Name: Выделение и идентификация клеток лимбальных ниш (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Изучите метод выделения и идентификации клеток лимбальных ниш человека для регенеративной медицины. Этот протокол помогает исследователям изучить сигнальные пути и потенциальное клиническое применение.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Благодарим Вэй Вана, Линцзюань Сюя и Жун Лю за руководство этой работой, Юнъяо Тана, Бихуэй Цзиня, Чуньсю Ю и Ли Гуйгана за предоставление некоторых материалов, Гуаньюй Су за написание рукописи, Сяо Чжоу, Ихун Сюна и Хуатао Се за исправление рукописи, а также Гуйгана Ли за его полное руководство. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (No 82070936, 81470606, 81570819), научно-исследовательским проектом по здравоохранению и планированию семьи провинции Хубэй (No . WJ2017M073), Десять лучших трансляционных медицинских исследовательских проектов больницы Тунцзи (No 2016ZHYX20), Проект по обучению молодых пионеров медицины в городе Ухань (No 2015whzqnyxggrc10), Глобальная программа набора талантов (G2022154028L), проект Национальной комиссии по здравоохранению провинции Хубэй в 2022 году (WJ2021ZH0005) и Фонд предметного строительства финансового департамента провинции Хубэй в 2022 году(42000022815T000000102)

Ткань лимбуса от доноров в возрасте от 50 до 60 лет была получена из Глазного банка Красного Креста, больница Тунцзи (Ухань, Китай). Протокол был одобрен Комитетом по этике Тунцзи и проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией.
1. Изоляция
<ol><li>Получение ткани лимба из среды хранения роговицы среднего срока и работа в асептических условиях на сверхчистом рабочем столе.</li>
	<li>Соскребите и удалите радужную оболочку и эндотелий вокруг роговицы с помощью стерильного хирургического круглого лезвия.</li>
	<li>Хирургическим лезвием разрезать ткань лимба на двенадцать одинаковых по размеру кусков с оставлением по 1 мм с обеих сторон роговицы и склеры.</li>
	<li>Переложите ткани лимба на культуральную планшет диаметром 3,5 см, добавьте 1 мл коллагеназы А (2 мг/мл, в среду DF-12), чтобы погрузить все ткани для пищеварения.</li>
	<li>Поместите планшет в клеточный инкубатор с температурой 37 °C, переваривайте лимбальные ткани в течение 18 часов. ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие процедуры обычно проводятся на второй день.</li>
	<li>Подготовьте 6-луночный культуральный планшет с покрытием из 5%-ной базальной мембранной матрицы (Matrigel).<ol><li>Покрыть 5%-ной мембранной матрицей основания (растворенной в MESCM [табл. 1]) на дне скважины.</li>
		<li>Подготовьте наконечники объемом 200 мкл и 1 мл, одну центробежную пробирку объемом 15 мл и одну 6-луночную чашку в стерилизованном пакете.</li>
		<li>Поместите стерилизованный пакет (включая наконечники и центробежную трубку) и новую 6-луночную пластину в среду -20 °C или -80 °C на 20 минут. Разморозьте матрицу мембраны основания в холодильнике при температуре 4 °C.</li>
		<li>Выньте предварительно охлажденные наконечники, центробежную трубку и 6-луночную пластину из среды -20 °C или -80 °C, а затем выполните следующие операции на сверхчистом верстаке.</li>
		<li>Перенесите 50 мкл 5% матрицы базальной мембраны в 1 мл MESCM с помощью наконечника на 200 мкл и осторожно и равномерно перемешайте.</li>
		<li>Перенесите 5%-ную матрицу базальной мембраны (растворенную в MESCM) в одну лунку 6-луночного культурального планшета, используя предварительно охлажденный наконечник объемом 1 мл.</li>
		<li>Осторожно и горизонтально встряхните 6-луночный планшет, поместите 6-луночный культуральный планшет в клеточный инкубатор при температуре 37 °C примерно на 1 ч, а затем выполните следующий шаг.</li>
	</ol></li>
	<li>После 18-часового расщепления выньте коллагеназу А-переваренную лимбальную ткань, останутся только видимые мелкие скопления и непереваренные ткани склеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопия с большим увеличением выявляет кластер, состоящий из множества плотно упакованных клеток (включая LNC).</li>
	<li>Используйте наконечник пипетки на 200 мкл, чтобы отделить кластеры от непереваренных тканей склеры под стереомикроскопом.</li>
	<li>Переложите грозди на культуральную планшет диаметром 3,5 см и погрузите их в 0,25% TE, а затем поместите планшет в клеточный инкубатор на 15 мин.</li>
	<li>Добавьте 1 мл MESCM с 10% нокаутной сывороткой, чтобы остановить клеточное пищеварение, и осторожно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать кластеры в отдельных клетках с помощью наконечника дозатора объемом 1 мл.</li>
	<li>Переложите клеточную суспензию в центробежную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин.</li>
	<li>Удалите надосадочную жидкость осторожно, не нарушая осаждение клеток, а затем добавьте 1 мл MESCM для ресуспендирования клеток.</li>
	<li>Пипетку вверх и вниз 2-3 раза до тех пор, пока осадок нижней клетки не будет равномерно взвешен в MESCM с помощью наконечника дозатора объемом 1 мл, и возьмите 20 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток.</li>
	<li>Перенесите клеточную суспензию на 6-луночный планшет, покрытый матрицей 5% базальной мембраны, с наконечником пипетки объемом 1 мл и увеличьте объем MESCM до 2,5 мл.</li>
	<li>Аккуратно встряхните 6-луночную пластину горизонтально, чтобы равномерно распределить ячейки.</li>
	<li>Перенесите клетки в культуральный инкубатор после того, как они будут сфотографированы и записаны. Наблюдайте и фотографируйте клетки ежедневно, а среду меняйте каждые 3-4 дня.</li>
</ol>2. Идентификация LNC
<ol><li>Иммунофлуоресцентное окрашивание<ol><li>Расщепляют LNC со дна планшета, используя 1 мл 0,25% TE в течение 5 минут в клеточном инкубаторе при температуре 37°C.</li>
		<li>Прекратите пищеварение, добавив 1 мл MESCM (содержащего нокаутную сыворотку), центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 мин и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость.</li>
		<li>Добавьте 1 мл MESCM для ресуспендирования клеток во взвешенном состоянии. Приготовьте суспензию клеток объемом 80 мкл (4 × 103 клеток на предметное стекло) для 4 предметных стекол (20 мкл/предметное стекло) и используйте центрифужную систему для нанесения клеток на предметные стекла микроскопа в соответствии с инструкциями производителя.</li>
		<li>Зафиксируйте клетки (прилипшие к предметным стеклам на шаге 3) с помощью 4% параформальдегида в течение примерно 10 мин, а затем пермеабилизируйте клетки на предметных стеклах 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин.</li>
		<li>Блокируют клетки в течение 1 ч 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) перед инкубацией с первичными антителами (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) на шейкере в течение ночи при 4 °C. После инкубации удаляют несвязанные первичные антитела, промывая (5 мин/промывка, 3 раза) предметные стекла PBST (PBS + 0,1% Tween 20).</li>
		<li>Инкубируют соответствующие вторичные антитела (вторичные антитела IgG к ослам у мышей TRITC [1:1000], антикроличьи IgG FITC [1:500], ослиные антимышиные IgG 488 [1:300], ослиные антикроличьи IgG 594 [1:400]) в течение 1 ч с подходящими неспецифическими антителами IgG IgG. Удалите несвязанное вторичное антитело с помощью PBST (5 мин/промывка, 3 раза).</li>
		<li>Окрасьте ядра 5 мкг/мл DAPI (4',6-Диамидино-2-Фенилиндол) и запечатайте предметные стекла.</li>
		<li>Выполните флуоресцентную визуализацию с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение: 400x; Время экспозиции: 50 мс).</li>
	</ol></li>
	<li>Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР)<ol><li>Возьмите набор для выделения РНК, чтобы извлечь общую РНК в соответствии с инструкциями производителя.</li>
		<li>Используйте набор для транскрипции кДНК большой емкости для обратной транскрибации 1-2 мкг общей РНК в кДНК.</li>
		<li>Проводят обратную транскрипцию (42 °C, 2 мин; 50 °C, 85 мин) и кПЦР (95 °C, 5 мин; 95 °C, 10 с, 40 циклов) в 20-мкловом растворе, содержащем кДНК (100 нг), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 мкл), универсальную ПЦР Master Mix (10 мкл) и ddH2O (до 20 мкл).</li>
		<li>Используйте метод сравнительной КТ (ΔΔCT)4,9 для изучения относительной экспрессии генов.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Характеристика LNC
<ol><li>Подсчет клеток (гемоцитометр)<ol><li>Расщепляют LNC со дна чашки, используя 0,25% TE, в течение 5 минут в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C.</li>
		<li>Прекратите пищеварение, добавив 1 мл MESCM (содержащего нокаутную сыворотку), центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 мин и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость.</li>
		<li>Добавьте 1 мл MESCM для ресуспендирования клеток, затем возьмите 10 мкл клеточной суспензии в центрифужную пробирку объемом 0,5 мл. Добавьте равный объем 0,4% раствора окрашивания трипанового синего.</li>
		<li>Поместите 10 мкл окрашенной клеточной суспензии на счетную зону гемоцитометра и накройте ее покровным стеклом для подсчета. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек в пяти средних квадратных областях определяется как «А»; количество клеток в 1 мл рассчитывается как 5А × 104 × 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Исследование маркеров LNC и BMMSC методом проточной цитометрии15<ol><li>Определение экспрессии SCF, CD73, CD90 и CD105 в LNC и BMMSC с помощью проточной цитометрии 15 (2-4 ×10 6 событий на образец, из каждого образца было получено 2 000 клеток, всего 550 000 клеток, которые были построены одновременно).</li>
		<li>Собирают и окрашивают клетки при температуре 20-30 °C в течение 15 мин в блокирующем буфере (3% BSA и 0,05% Tween-20 в PBS) с использованием предварительно меченных антител (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] и CD105 [1:50]) в соответствии с инструкцией к набору.</li>
		<li>Выполните анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с помощью проточного цитометра. В данном исследовании использовалось программное обеспечение FACS Diva и программное обеспечение FlowJo. Для каждого образца запишите 10 000 событий, а также создайте и проанализируйте живые клетки.</li>
	</ol></li>
</ol>

Протокол выделения, культивирования и идентификации лимбальных нишевых клеток человека

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
<li>O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+tissue+equivalents+for+the+treatment+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency.</a> Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).</li>
<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Ни один из авторов не раскрывает соответствующую финансовую информацию.

Прозрачность роговицы обычно поддерживается за счет регулярного расположения и распределения мелких волокон (25-30 нм в диаметре) в строме роговицы, что имеет решающее значение для нормальной остроты зрения16. В мире насчитывается 253 миллиона людей с нарушениями зрения, 36 миллионов из которых слепые. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает слепоту роговицы одной из самых серьезных опасностей для зрения человека, на которую приходится 5,1% всех случаев слепоты ...

Заболеваемость дефицитом эпителиальных стволовых клеток роговицы (CESD), также называемая дефицитом лимбальных стволовых клеток (LSCD)1, и регенерация эпителия роговицы (CES) становятся все более и более актуальными из-за инфекции и травмы роговицы. При отсутствии надлежащего лечения CESD может привести к слепоте, которая требует пересадки роговицы. В результате, регенерация CES становится все более значимой. Существует группа поддерживающих клеток, называемых клетками лимбальной ниши (LNC), которые обеспечивают необходимую поддержку функции CES. Лимбальные стромальные стволовые клетки были впервые выделены Polisetty et al.2 и идентифицированы Xie et al.3 как LNC, которые локализуются в лимбальном эпителии и строме лимба. LNC являются ключевыми поддерживающими стволовыми клетками края роговицы и, выполняя функцию МСК костного мозга (BMMSC), могут развиваться в эпителиальные клетки роговицы и стромальные клетки роговицы и т. д.3,4,5,6,7. Предыдущие исследования показали, что свойства стволовых клеток LNC более примитивны, чем BMMSC8, которые уже широко используются в клинике. ЛНК могут даже стать следующим жизнеспособным вариантом после МСК, особенно для лечения КЭСР. Являясь важными опорными клетками для CES, LNC также являются стволовыми клетками, полученными из «нишевой» структуры лимба. LNC могут играть ключевую роль в дедифференцировке зрелых эпителиальных клеток роговицы (MCEC) до CES9. Тем не менее, исследования ЛНК все еще относительно недостаточны, и нет единого мнения о терминологии, изоляции, очистке, идентификации и характеристиках ЛНК. Некоторые исследователи называют LNC стромальными стволовыми клетками, полученными в результате лимбальной биопсии 10, лимбальными мезенхимальными стволовыми клетками 11, лимбальными стволовыми клетками фибробластов12 и лимбальными мезенхимальными стромальными клетками13. Поскольку характеристики роста LNC не были подробно описаны, а также из-за их многообещающего научного и клинического применения, и они могут стать одним из наиболее важных клинических инструментов в будущем, необходимо обобщить выделение, очистку, идентификацию и характеристики LNC.
Согласно предыдущему исследованию14, ЛНК в основном присутствуют в лимбальном эпителии и строме лимба. Этот протокол включает в себя обработку тканей лимба с помощью коллагеназы А, получение кластера, состоящего из LEPC и LNCs, и расщепление его на отдельные клетки с 0,25% трипсин-ЭДТА (ТЭ). Затем LNC селективно культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) для очистки. Протокол, описанный в этой статье, прост и обладает высокой эффективностью в получении человеческих LNC в больших количествах.
Подробная процедура выделения, культивирования и идентификации LNC была записана в видео для ученых, заинтересованных в изучении LNC, и при необходимости ее можно удобно повторить.

<table><tbody><tr><td>4',6-Диамидино-2-фенилиндол</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu; г/мл</td></tr><tr><td>амфотерицина B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 г/м; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Бычья сыворотка альбумин</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Клеточный инкубатор</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>Центрифужная система</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td> <td>12-коллагеназа</td></tr> <tr><td>А</td><td>Рош</td><td>10103578001</td><td>2 мг/мл</td></tr><tr><td>Конфокальный микроскоп</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700-Культуральная</td><td></td></tr> <tr><td>тарелка</td><td>3500356</td><td></td><td>35 мм</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Вторичное антитело</td><td>ThermoFisher</td><td>31568 1</td><td>:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td>Tree</td> <td>Star-Flow</td></tr> <tr><td>Цитометр</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Флуоресцентный микроскоп</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Гентамицин</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu; г/мл</td></tr><tr><td>гемоцитометра</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Transcription Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Инвертированный фазово-контрастный микроскоп</td><td>&nbsp; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (инсулин, трансферрин, селенит натрия)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu; г/мл инсулина, 5 мкм; г/мл трансферрина, 5 нг/мл селенита натрия</td></tr><tr><td>KnockOut SR Замена сыворотки для ЭСК/ИПСК</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Параформальдегид</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4,00%</td></tr> <tr><td>Параформальдегид</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&бета;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Флуоресцентный количественный ПЦР в реальном времени</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td><td></td></tr> <tr><td>Plus-Рекомбинантный человеческий FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 нг/мл</td></tr><tr><td>Рекоминантный фактор лейкемии человека (Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 нг/мл</td></tr><tr><td>RNeasy Mini RNA Isolation Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Стереомикроскоп</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Стерильное хирургическое круглое лезвие</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>размер 10</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Mix</td><td>Applied</td><td>Biosystems 4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>Трипан синий</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0,40%</td></tr><tr><td>Трипсин-ЭДТА</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>Твин 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Универсальная ПЦР мастер-смесь</td><td>Прикладные биосистемы</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

Выделение и идентификация клеток лимбальных ниш

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Здесь мы сообщаем о стандартной процедуре выделения и идентификации клеток лимбальной ниши (LNCs). Ткань лимбуса, полученная из глазного банка, использовалась для выделения LNCs. Ткань делили на 12 частей в асептических условиях и переваривали в течение 18 ч при 37 °С в инкубаторе клеточных культур с использованием коллагеназы А для получения клеточных кластеров с LNC и клетками-предшественниками лимбального эпителия. Клеточные кластеры дополнительно расщепляли в течение 15 мин при 37 °C с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА для получения единичных клеток, а затем культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) на пластиковой поверхности, покрытой 5% Матригелем. Клетки пассажировали при слиянии 70%, а LNC идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции, количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) и проточной цитометрии. Первичные ЛНК были изолированы и пассированы более 12 раз. Пролиферационная активность ЛНК от Р4 до Р6 была самой высокой. LNC экспрессировали более высокие маркеры стволовых клеток, чем BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR и PDGFRβ). Кроме того, результаты показали, что P4 LNC равномерно экспрессируют VIM, CD90, CD105 и PDGFRβ, но не Pan-CK, который может быть использован в качестве маркера для идентификации LNC. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 95%, 97%, 92% и 11% LNC экспрессировали CD73, CD90, CD105 и SCF соответственно, в то время как в BMMSC они составляли 68%, 99%, 20% и 3%. Стандартный процесс выделения и идентификации LNC может обеспечить надежную лабораторную основу для широкого использования LNC.

Рост LNC ЛНК были успешно выделены по методу расщепления коллагеназы А (2 мг/мл) ткани корнеосклерального ободка, описанному выше (рис. 1). В соответствии с ранее опубликованным исследованием3, после расщепления коллагеназы А под микроскопом визуализировали гусеничные кластеры (рис. 2). Доля веретенообразных клеток постепенно увеличивалась по мере пассажа клеток. Веретенообразные клетки могут расти на покрытых 5% пласт...

Здесь мы представляем протокол для выделения и идентификации клеток лимбальной ниши человека.

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Наши исследования сосредоточены на реконструкции лимбальной ниши для лечения дефицита лимбальных стволовых клеток и восстановления зрения пациента. Мы пытаемся ответить на вопрос, являются ли лимбальные нишевые клетки ключевыми клетками, поддерживающими функцию лимбальных стволовых клеток, и если да, то как это работает. Недавние исследования показали, что субконъюнктивальная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга предотвращает дефицит лимбальных стволовых клеток в глазах, обожженных щелочью.Одной из технологий, используемых в настоящее время для продвижения наших исследований, является секвенирование одиночных клеток, которое может анализировать активность ключевых сигнальных путей на уровне одной клетки для характеристики клеток лимбальной ниши. Несмотря на то, что LNC имеют потенциал стать важным клиническим инструментом в будущем, их характеристики роста не были изучены достаточно подробно. Рассматривая их перспективное научное и клиническое применение, необходимо обобщить выделение, очистку, идентификацию и характеристики ЛНК.

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Мы сообщаем технику для изготовления micropockets пределах electrospun мембран, в которых для изучения поведение клеток. В частности, мы описываем комбинацию microstereolithography и электроформования для производства PLGA (поли (лактид-со-гликолида)) роговицы биоматериала устройств, оснащенных microfeatures.

Сочетание Microstereolithography и электропрядения Произвести Мембраны Оснащен ниши для роговицы регенерации

В этой статье мы описываем принципы разработки и проведения эксперимента по многоцветной трассировке родословной с использованием мышей R26R-Ffetti. Мы предоставляем специальный протокол для отслеживания эпителиальных клеток роговицы, который может быть модифицирован для других тканей, представляющих интерес.

Метод Lineage Tracing из клетки роговицы, используя Multi-Color Люминесцентная Reporter Мышей

Представлен пример аденовирусной генной терапии на роговице человека, культивируемых диабетическими органами, направленный на нормализацию замедленного заживления ран и заметное снижение экспрессии маркеров эпителиальных стволовых клеток в этих роговицах. В ней также описывается оптимизация этого процесса в культурах лимбального эпителия, обогащенных стволовыми клетками.

Аденовируса генной терапии для больных сахарным диабетом Кератопатия: Влияние на заживление ран и стволовых клеток маркера выражение в человеческих органов культивируемых роговиц и лимбальных эпителиальных клеток

В следующей статье дается легко воспроизводимый метод для эффективного создания устойчивой модели мыши дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD). Эта модель животных полезна при тестировании и сравнения эффективности лечения заболеваний лимбальных стволовых клеток.

Простой механический Процедура создания лимбальных Дефицит стволовых клеток у мышей

Открытая нормальная окулярная поверхность состоит из роговицы и конъюнктивы. В конъюнктиве присутствуют эпителиальные клетки, бокаловидные клетки и иммунные клетки. Здесь описывается неинвазивная методика цитологии слепоты с использованием устройства для слепочной цитологии и проточной цитометрии для анализа иммунных клеток в конъюнктиве.

Неинвазивный способ выделения и фенотипических клеток из конъюнктивы

Этот протокол вводит метод простой двухступенчатый для дифференциации роговицы нейральные стволовые клетки эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток xeno - и фидер культуры клеток свободных условиях. Представленные здесь методы культуры клетки позволяют экономически эффективным, крупномасштабного производства клинической качества клеток роговицы клетки терапии применение.

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Лакримальная железа (LG) имеет два типа клеток, выражающих атоин(ЗСМА) ( и миоэпителиальные клетки (МЭК) и перициты. MECs имеют эктодермального происхождения, найденные во многих железистых тканях, в то время как перициты являются сосудистыми гладкими мышечными клетками эндодермального происхождения. Этот протокол изолирует МЭЦ и перициты из мурин-ЛГ.

Изоляция миоэпителиальных клеток от взрослых Мурина Лакрималила и Субмандибулярных желез

Здесь представлен протокол выделения и амплификации аэробных и факультативных анаэробных конъюнктивальных комменсальных бактерий мышей с использованием уникального глазного мазка и этапа обогащения на основе культуры с последующей идентификацией микробиологическими методами и масс-спектрометрией MALDI-TOF.

Конъюнктивальная комменсальная изоляция и идентификация у мышей

Этот протокол описывает метод индуцирования точного и воспроизводимого повреждения роговицы и лимбальной щелочи на мышиной модели. Преимущество протокола заключается в том, что он позволяет равномерно распределить повреждение сильно изогнутой роговицы и лимба мыши.

Индукция повреждения роговицы и лимбальной щелочи с использованием техники панч-трепан на мышиной модели

Мы разработали модель тяжелого воспаления роговицы на крысах с помощью кюретажа эпителия роговицы в сочетании с наложением роговичных швов. В исследовании оценивались паттерны воспаления роговицы, пролиферация эпителия и изменения в лимбальных стволовых клетках в условиях воспаления.

Создание модели тяжелого воспаления роговицы у крыс на основе кюретажа эпителия роговицы в сочетании с роговичными швами

Здесь мы представляем протокол получения высококачественных одноклеточных суспензий из целых роговиц мышей посредством последовательного расщепления с помощью коллагеназы А и трипсина. Этот метод даёт жизнеспособные одиночные клетки с высокой целостностью РНК, что делает их совместимыми с последующим применением, такими как секвенирование одноклеточной РНК и потоковый цитометрy.

Протокол для извлечения суспензии с одной клеточной суспензией роговицы мыши

Изучите метод выделения и идентификации клеток лимбальных ниш человека для регенеративной медицины. Этот протокол помогает исследователям изучить сигнальные пути и потенциальное клиническое применение.

Выделение и идентификация клеток лимбальных ниш

Больше видео