Name: Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri i meccanismi di rigenerazione retinica nei girini di Xenopus laevis. Questo metodo permette di studiare il ruolo delle cellule gliali di Müller e della neuroinfiammazione per sviluppare terapie future contro le malattie retiniche degenerative umane.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a M.P. da parte dell'Association Retina France, della Fondation de France, della FMR (Fondation Maladies Rares), della BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e dell'UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in collaborazione con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Generazione della degenerazione retinica per studiare le strategie di riparazione cellulare in Xenopus

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Vantaggi e svantaggi dei vari paradigmi di lesione retinica nei girini di Xenopus
Lesione meccanica della retina Varie lesioni chirurgiche della retina neurale sono state sviluppate nei girini di Xenopus. La retina neurale può essere completamente rimossa 15,16 o asportata solo parzialmente16,17. La lesione meccanica qui pr...

Milioni di persone in tutto il mondo sono afflitte da varie malattie degenerative della retina che portano alla cecità, come la retinite pigmentosa, la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Ad oggi, queste condizioni rimangono in gran parte incurabili. Gli attuali approcci terapeutici in fase di valutazione includono la terapia genica, i trapianti di cellule o tessuti, i trattamenti neuroprotettivi, l'optogenetica e i dispositivi protesici. Un'altra strategia emergente si basa sull'auto-rigenerazione attraverso l'attivazione di cellule endogene con potenziale di cellule staminali. Le cellule gliali di Müller, il principale tipo di cellule gliali della retina, sono tra le fonti cellulari di interesse in questo contesto. In caso di lesione, possono dedifferenziarsi, proliferare e generare neuroni 1,2,3. Sebbene questo processo sia molto efficace nel pesce zebra o nello Xenopus, è in gran parte inefficiente nei mammiferi.
Ciononostante, è stato dimostrato che trattamenti appropriati con proteine mitogeniche o sovraespressione di vari fattori possono indurre il rientro del ciclo cellulare della glia di Müller nei mammiferi e, in alcuni casi, innescare il loro successivo impegno di neurogenesi 1,2,3,4,5. Questo rimane, tuttavia, largamente insufficiente per i trattamenti. Pertanto, è necessario aumentare la nostra conoscenza dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione per identificare molecole in grado di trasformare in modo efficiente le proprietà delle cellule staminali di Müller in nuove strategie terapeutiche cellulari.
Con questo obiettivo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di lesione in Xenopus che innescano la degenerazione delle cellule retiniche. Qui, presentiamo (1) una lesione retinica meccanica che non è specifica per il tipo di cellula, (2) un modello di ablazione cellulare condizionale e reversibile che utilizza il sistema NTR-MTZ che prende di mira le cellule dei bastoncelli, (3) un knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9, un modello di retinite pigmentosa che innesca la degenerazione progressiva delle cellule dei bastoncelli e (4) un CoCl2-modello citotossico indotto che, a seconda della dose, può colpire in modo specifico i coni o portare a una più ampia degenerazione delle cellule retiniche. Evidenziamo le particolarità, i vantaggi e gli svantaggi di ciascun paradigma.

<table><tbody><tr><td>1,2-Propandiolo (propil... ne glicole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto &ge; 99,8%</td> <td>Prodotti chimici VWR</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-caspasi 3 (coniglio)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9661S</td><td>Diluizione 1/300</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP (pollo)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-M-Opsina (coniglio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo, Alexa Fluor 594 (capra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Diluizione 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Otx2 (coniglio)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Diluizione 1/100</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 488 (capra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Diluizione 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 594 (capra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Diluizione 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Recoverina (coniglio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rodopsina (topo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Diluizione 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-S-Opsina (coniglio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento Apoptotis (sistema TUNEL fluorimetrico senza uscita)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Soluzione madre 10%</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Soluzione madre 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge; 99,5%</td> <td>Sostanze chimiche VWR</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1,02382</td><td>Utilizzare a 0,1 M</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Capillary Glass modello GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto(II) esaidrato (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Soluzione madre 100 mM</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab diluente&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo elettronico rotativo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eosina 1% acquosa</td><td>RAL Diagnostica</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina lisina destrano&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Glicerina albumina secondo Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Utilizzo al 3% in acqua</td></tr><tr><td>Ematossilina (Mayer's Hemalun)</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sale</td> <td>di potassioSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Ormone gonadotropina corionica umana</td><td>MSD Salute animale</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico fumante, 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina cloridrato monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Utilizzare al 2% in 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>M3761</td><td>Utilizzare a 10 mM</td></tr><tr><td>Punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette (P-97 Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modello P-97</td><td>Programma : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio per preservare la fluorescenza, FluorSave Reagent</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Lama per ultramicrotomo</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Ago Agani 25 G x 5/8''</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Portaspilli nichelato</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto filtrante in nylon (tessuto setacciante) NITEX, apertura a rete 1.000 &; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina histowax senza DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide (32%)</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze EM-15714-S Utilizzo</td><td>al 4% in 1x PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Stampi monouso per inclusione</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Pestello</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 100 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microiniezione PicoSpritzer</td><td>Prodotti per strumentazione</td><td>Parker PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pins&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polisaccarosio (Ficoll PM 400 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Utilizzare al 3% in 0,1x MBS</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cibo per avannotti in polvere : sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Dissezione a forbice</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp;</td><td>&nbsp; KNITTEL Vetro</td><td>VS11171076FKA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore per vetrini</td><td>Kunz instruments</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio sale trisodico diidrato (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>VWR chemicals</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio 30% soluzione acquosa (NaOH)</td><td>Sostanze chimiche VWR</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Siringhe Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe monouso Omnifix-F Solo 1 mL</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>crRNA trans-attivante (tracrRNA)</td><td>Tecnologie</td> <td>DNA integrate</td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Illuminatore a fluorescenza</td><td>X-Cite&nbsp;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>Xilene &ge; 98,5%&nbsp;</td><td>Prodotti chimici VWR</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Le malattie neurodegenerative della retina sono le principali cause di cecità. Tra le numerose strategie terapeutiche esplorate, l'autoriparazione stimolante è emersa recentemente come particolarmente attraente. Una fonte cellulare di interesse per la riparazione della retina è la cellula gliale di Müller, che ospita un potenziale di cellule staminali e una straordinaria capacità rigenerativa negli anamnioti. Questo potenziale è, tuttavia, molto limitato nei mammiferi. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione retinica in modelli animali con capacità rigenerative dovrebbe fornire informazioni su come sbloccare la capacità latente delle cellule di Müller dei mammiferi di rigenerare la retina. Si tratta di un passo fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa. A questo scopo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di danno retinico in Xenopus: una lesione retinica meccanica, una linea transgenica che consente l'ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi, un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e un modello citotossico guidato da iniezioni intraoculari di CoCl2 . Evidenziandone i vantaggi e gli svantaggi, descriviamo qui questa serie di protocolli che generano varie condizioni degenerative e permettono lo studio della rigenerazione retinica in Xenopus.

Lesione meccanica della retina Le sezioni retiniche dei girini sottoposti alla lesione meccanica descritta nella sezione 1 del protocollo mostrano che la lesione retinica comprende tutti gli strati del tessuto pur rimanendo limitata al sito di puntura (Figura 2A,B).
Ablazione condizionale delle cellule dei bastoncelli con il sistema NTR-MTZ Gli occhi di girini transgenici Anestetizzati Tg(rho:GFP-NTR)</e...

Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.

Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Il mio laboratorio si occupa di rigenerazione retinica. Stiamo usando la rana Xenopus come sistema modello. Questo anfibio è infatti piuttosto affascinante perché a differenza dei mammiferi, come noi, può rigenerare la sua retina in modo molto efficiente in caso di lesioni.E stiamo studiando il meccanismo sottostante perché, in futuro, potrebbe essere utile per innescare la rigenerazione retinica in pazienti umani affetti da malattie neurodegenerative retiniche. Recentemente abbiamo scoperto che oltre alle cellule staminali nella periferia della retina e nell'epitelio pigmentato retinico, anche le cellule neurogliali possono essere reclutate per la rigenerazione retinica in caso di lesioni. E così ora stiamo studiando i legami tra la neuroinfiammazione e la capacità rigenerativa di queste cellule.Sembra infatti che la nicchia neuroinfiammatoria sia un attore chiave nella modulazione della rigenerazione della retina. Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella rigenerazione retinica, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di lesione retinica in Xenopus. Il primo è una lesione meccanica della retina.La seconda è una linea transgenica che consente l'ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi. Il terzo è un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e, per finire, un modello citotossico guidato dall'iniezione intraoculare di cloruro di cobalto o CoCl2. Il laboratorio che mi ha ospitato ha dimostrato che, sebbene Xenopus sia in grado di rigenerare la sua retina, l'efficienza è molto variabile e dipende dagli stadi del girino o dalla specie, Xenopus laevis o tropicalis.Questo rende Xenopus un modello fantastico per illustrare i meccanismi molecolari che innescano o limitano la rigenerazione della retina.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l'iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

Il video dimostra un metodo per coltivare cellule gangliari retiniche primarie da embrioni di pesce zebra. Gli embrioni in fase iniziale vengono sottoposti a dissezione per isolare gli occhi, che vengono successivamente dissociati meccanicamente in una sospensione di cellule gangliari retiniche. Questa sospensione cellulare viene coltivata su vetrini coprioggetti rivestiti con proteine adesive per facilitare lo sviluppo degli assoni.

Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

Questo video mostra una procedura per indurre la degenerazione retinica in zebrafish adulti utilizzando lesioni laser. Il laser prende di mira le cellule fotorecettrici della retina, innescando la morte cellulare e un processo degenerativo. Questo danno attiva le cellule della glia di Müller (MG), portando alla loro dedifferenziazione in progenitori di cellule staminali che aiutano nella rigenerazione retinica.

Modellazione della degenerazione e della rigenerazione retinica nel pesce zebra utilizzando una lesione laser focale

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

Xenopus laevis girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco nero. Questo comportamento è guidato dalla loro visione. Sulla base di questo comportamento, vi presentiamo un semplice test per testare la funzione visiva dei girini.

Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in<em&gt; Xenopus laevis</em

Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l'efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici.

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Scopri i meccanismi di rigenerazione retinica nei girini di Xenopus laevis. Questo metodo permette di studiare il ruolo delle cellule gliali di Müller e della neuroinfiammazione per sviluppare terapie future contro le malattie retiniche degenerative umane.

Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus

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