Name: Paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di Drosophila del disturbo dello spettro autistico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri cinque paradigmi comportamentali standard per valutare i deficit correlati all'autismo nel modello Drosophila, inclusi saggi di aggressività, corteggiamento e grooming. Questi metodi consentono una caratterizzazione precisa delle anomalie comportamentali.

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Siamo immensamente grati a Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) e Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) per la configurazione del saggio di assuefazione e scelta dell'odore, Pavan Agrawal (MAHE) per i suoi preziosi suggerimenti sul test di aggressione, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) per aver condiviso il suo prototipo di camera di corteggiamento e le linee di mosca mutanti Fmr1 e Gaurav Das (NCCS, Pune) per aver condiviso la linea MB247-GAL4. Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), il National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Giappone), la Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, India) e il National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, India) per le linee di Drosophila . Il lavoro nel laboratorio è stato sostenuto da sovvenzioni da SERB-DST (ECR/2017/002963) ad AD, borsa di studio DBT Ramalingaswami assegnata ad AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) e supporto istituzionale da IIT Kharagpur, India. SD e SM ricevono borse di dottorato da CSIR-Senior Research Fellowship; PM riceve un dottorato di ricerca da MHRD, India.

Drosofila Modelli per i tratti genetici e comportamentali del disturbo dello spettro autistico

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La Drosophila è utilizzata come organismo modello per la ricerca sui disturbi neurologici umani a causa di un alto grado di conservazione delle sequenze geniche tra la mosca e i geni della malattia umana9. Numerosi e robusti paradigmi comportamentali lo rendono un modello attraente per lo studio dei fenotipi manifestati nei mutanti che ricapitolano le malattie umane. Poiché centinaia di geni sono implicati nel disturbo dello spettro autistico (ASD), non esiste un modello comune di ASD in nessun organismo modello. Quindi, per ogni mutante, i ricercatori devono prima stabilire fenotipi simili all'ASD nel moscerino. In questo articolo, abbiamo cercato di semplificare il processo proponendo l'uso di cinque paradigmi comportamentali di mosca in concerto per tale valutazione. Questi paradigmi sono impiegati nei moscerini per valutare i principali e comuni deficit comportamentali dei pazienti umani con ASD: deficit sociali e di comunicazione, miglioramento dei comportamenti ripetitivi e un difetto di assuefazione. Se una mutazione del gene del moscerino mostra difetti in tutti o nella maggior parte di questi cinque paradigmi, potrebbe essere una forte indicazione di uno scenario simile all'ASD.
La maggior parte dei paradigmi comportamentali qui descritti sono stati utilizzati più volte nella letteratura precedente per risolvere diverse domande di ricerca. Non è raro trovare variazioni nelle tecniche tra i diversi studi. Le modifiche alle tecniche sono state apportate per soddisfare le esigenze di ricerca e per soddisfare la domanda specifica da risolvere. Ad esempio, nel test di corteggiamento, il comportamento di corteggiamento innato e appreso può essere quantificato nei confronti di una mosca tester che può essere un maschio immaturodi 65 anni, una femmina verginedi 66,67, una femmina preaccoppiatadi 68,69,70, una femmina vergine congelata di65 o anche una femmina decapitatadi 19 anni . Nel metodo descritto in questo articolo, le femmine pre-accoppiate di tipo selvatico sono state utilizzate come tester per verificare il modello di corteggiamento di una mosca modello ASD maschio. La ricettività essutale diuna femmina preaccoppiata è relativamente inferiore a quella di una mosca vergine71. Di conseguenza, il numero di incontri di corteggiamento maschile e la loro durata sono più verso una femmina accoppiata che verso una vergine; Allo stesso modo, la latenza alla copulazione è anche più lunga di quella delle femmine tester vergini, nel qual caso la copulazione precoce porta a una riduzione dell'indice di corteggiamento, riducendo la possibilità di un confronto efficace tra i genotipi. Quindi, l'uso di una femmina preaccoppiata come tester fornisce una migliore analisi comparativa del comportamento di corteggiamento di una mosca ASD rispetto a una mosca di tipo selvatico. D'altra parte, l'uso di femmine vergini può fornire ulteriori informazioni che possono essere mascherate quando vengono utilizzate femmine accoppiate. L'uso di femmine accoppiate può anche influenzare e alterare il comportamento di corteggiamento maschile. In sintesi, si suggerisce che i ricercatori scelgano la loro strategia sperimentale e i dettagli a seconda della necessità dell'esperimento specifico.
È necessario essere cauti qui prima di applicare la tecnica in uno o tutti gli omologhi di mosche dei geni ASD. Tutti questi paradigmi comportamentali sono regolati da un numero specifico e piccolo di neuroni. L'espressione di un certo gene deve essere stabilita prima di procedere a uno specifico paradigma comportamentale. Ad esempio, se l'omologo del moscerino di un gene associato all'ASD non è espresso nei neuroni del corpo dei funghi o nei neuroni glutammatergici, allora il comportamento di corteggiamento e toelettatura potrebbe non essere influenzato nel suo mutante.
Un altro punto a cui i ricercatori devono prestare attenzione è che la mancanza di un difetto non significa sempre che la mutazione non abbia alcun ruolo. Ad esempio, negli esperimenti sul comportamento di toelettatura con mutanti Fmr1 , il conteggio totale degli attacchi di toelettatura non è significativamente inferiore nei mutanti rispetto ai controlli, mentre altri parametri come l'indice di toelettatura, ecc. dimostrano un difetto nel comportamento di toelettatura. Ciò può essere spiegato dal prolungamento di ogni incontro di toelettatura nei mutanti Fmr1 , con conseguente conteggio basso del numero totale di attacchi nonostante la durata totale dell'incontro sia molto più alta. Ciò sottolinea la necessità di quantificare più parametri per ciascun modello comportamentale. Inoltre, va ricordato che il termine ASD copre un'ampia gamma di malattie causate da variazioni in uno qualsiasi delle centinaia di geni, che si traducono in fenotipi eterogenei con vari gradi di penetranza tra gli individui colpiti. Ad esempio, il deficit di assuefazione si osserva in alcuni pazienti ma non in tutti. Lo stesso ci si aspetterebbe nei modelli di mosca della malattia.
Per l'analisi del comportamento aggressivo, in questo studio sono stati presi in considerazione diversi tipi di parametri aggressivi: affondo, minaccia alare, zuffa, ecc. (Figura 1)30. Ogni incontro deve essere identificato e conteggiato come tipo di incontro individuale o come conteggio totale degli attacchi. È importante prima familiarizzare con i modelli di aggressività dei moscerini maschi, che sono descritti in59,72 e mostrati nella Figura 1. Durante il conteggio dei numeri di incontri aggressivi, i punti di inizio e fine di un singolo evento di aggressione devono essere chiaramente identificati; Più tipi di schemi di aggressività potrebbero essere mostrati all'interno di un singolo incontro, seguito dalla fine dell'incontro. Un attacco di aggressione è considerato finito quando una mosca smette di mostrare uno qualsiasi dei comportamenti aggressivi o del movimento per 2 secondi o interrompe l'attacco e inizia ad allontanarsi.
La maggior parte di questi paradigmi comportamentali ha molteplici variazioni e avanzamenti descritti da più laboratori. Ciascuna delle modifiche specifiche era stata creata per soddisfare le esigenze di uno scopo specifico. Allo stesso modo, le tecniche di quantificazione o analisi automatizzate e basate su algoritmi hanno liberato queste tecniche dalle possibilità di errori manuali. In questo articolo, sono state dimostrate le tecniche più basilari con il minor numero di requisiti materiali, nella speranza che queste tecniche possano essere facilmente adottate e utilizzate dal maggior numero di ricercatori.

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici. Comprende una serie di disturbi complessi del neurosviluppo caratterizzati da deficit multicontestuali e persistenti nella comunicazione e nell'interazione sociale e dalla presenza di modelli comportamentali e di attività ristretti e ripetitivi e interessi1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), a 1 bambino su 100 viene diagnosticato l'ASD in tutto il mondo con un rapporto maschi/femmine di 4,22. La malattia si manifesta nel secondo o terzo anno di vita. I bambini con ASD mostrano una mancanza di interesse per la reciprocità socio-emotiva, la comunicazione non verbale e le capacità relazionali. Esibiscono comportamenti ripetitivi come il movimento motorio stereotipato, il seguire la routine inflessibile e ritualizzata e un'intensa attenzione agli interessi ristretti. I bambini con ASD mostrano un alto grado di risposta al tatto, all'olfatto, al suono e al gusto, mentre la risposta al dolore e alla temperatura èrelativamente bassa. Anche la penetranza di questo disturbo è diversa tra i diversi pazienti affetti da ASD e quindi la variabilità aumenta.
L'attuale diagnosi clinica di ASD si basa sulla valutazione comportamentale degli individui in quanto non esiste un test genetico comune basato su biomarcatori di conferma che copra tutte le forme di ASD3. Decifrare le basi genetiche e neurofisiologiche sarebbe utile per indirizzare le strategie di trattamento. Nell'ultimo decennio, un ampio corpus di ricerche ha portato all'identificazione di centinaia di geni che sono stati eliminati o mutati o i cui livelli di espressione sono alterati nei pazienti con ASD. La ricerca in corso enfatizza la convalida del contributo di questi geni candidati utilizzando organismi modello come il topo o il moscerino della frutta, in cui questi geni vengono eliminati o abbattuti, seguiti da test per deficit comportamentali simili all'ASD e chiarimenti dei percorsi genetici e molecolari sottostanti che causano le anomalie. Un modello murino che ricapitola le variazioni del numero di copie (CNV) nei loci cromosomici umani 16p11.2 mostra alcuni dei difetti comportamentali dell'ASD 4,5,6. L'esposizione prenatale a un farmaco teratogeno, l'acido valproico (VPA) è un altro modello murino che raffigura tratti simili all'ASD 7,8 umano. Inoltre, esiste una serie di modelli murini che mostrano autismo associato alla sindrome genetica, ad esempio, modelli sindromici a singolo gene causati da mutazioni in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelli non sindromici a singolo gene causati da mutazioni in geni come Cntnap2, Shank, Neurexin o Neuroligin 5.
Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è un altro importante organismo modello per lo studio delle basi cellulari, molecolari e genetiche di una pletora di malattie umane9, tra cui l'ASD. La Drosophila e l'uomo condividono processi biologici altamente conservati a livello molecolare, cellulare e sinaptico. I moscerini della frutta sono stati utilizzati con successo negli studi sull'ASD 10,11,12 per caratterizzare i geni legati agli ASD e decifrare il loro ruolo esatto nella sinaptogenesi, nella funzione sinaptica e nella plasticità, nell'assemblaggio dei circuiti neurali e nella maturazione; Si è scoperto che gli omologhi dei geni associati all'ASD hanno un ruolo nella regolazione del comportamento sociale e/o ripetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Il moscerino della frutta ha anche funzionato come modello per lo screening dei geni ASD e delle loro varianti 15,22,23. La sfida più grande nella ricerca sull'ASD nei moscerini è che, a differenza di altri modelli di malattia, non esiste un unico modello di mosca ASD. Per comprendere l'impatto delle mutazioni o dell'abbattimento di uno specifico gene ASD, un ricercatore deve convalidare se i fenotipi comportamentali imitano sufficientemente i sintomi dei pazienti con ASD e quindi procedere verso la comprensione delle basi molecolari o fisiologiche dei fenotipi.
Pertanto, il rilevamento di fenotipi ASD-like è vitale per la ricerca sull'ASD nel modello di mosca. Nel corso degli anni sono emerse una manciata di tecniche comportamentali che ci consentono di rilevare anomalie come deficit nel comportamento/interazione sociale, comunicazione, comportamenti ripetitivi e reattività agli stimoli. Inoltre, diverse modifiche e aggiornamenti di queste tecniche comportamentali sono stati apportati in diversi laboratori per soddisfare requisiti specifici come l'upscaling, l'automazione dei saggi, le letture, la quantificazione e i metodi di confronto. In questo articolo video, vengono dimostrate le versioni più basilari di cinque paradigmi comportamentali che, in combinazione, possono essere utilizzati per rilevare gli esiti comportamentali simili all'ASD nel modo più semplice.
L'aggressività è un comportamento innato conservato evolutivamente che influenza la sopravvivenza e la riproduzione24. Il comportamento aggressivo nei confronti dei conspecifici è influenzato dalla "motivazione alla socializzazione"25,26 e dalla "comunicazione"27, entrambi compromessi negli individui affetti da ASD. Il comportamento aggressivo è ben descritto in Drosophila e la sua quantificabilità attraverso il robusto saggio di aggressività 28,29,30 e una base genetica e neurobiologica ben compresa31 lo rende un paradigma comportamentale adatto 32 per valutare il fenotipo ASD in un modello di mosca. L'aggressività è influenzata dall'isolamento sociale lontano da un ambiente sociale, che porta a una maggiore aggressività; Lo stesso è stato osservato quando i moscerini maschi sono alloggiati in isolamento per alcuni giorni33,34. Un altro test comportamentale che quantifica la socievolezza nei moscerini è il Social Space Assay35, che misura le distanze tra i vicini più prossimi e le distanze tra i moscerini in un piccolo gruppo di mosche, rendendolo perfettamente adatto per testare i ruoli degli ortologhi del gene ASD nei moscerini 12,21,36,37 e nei modelli di mosche ASD indotti dall'ambiente 38. 39.
Il test di corteggiamento della Drosophila è un altro paradigma comportamentale frequentemente utilizzato per analizzare l'alterazione delle abilità sociali e comunicative su circuito o manipolazione genetica, compresi i geni correlati all'autismo 18,19,21,40. I modelli di comportamento ripetitivi sono prevalenti nei pazienti con ASD, che si ricapitola nelle mosche con il comportamento di toelettatura, una serie di azioni distinte e stereotipate eseguite per la pulizia e altri scopi. È stato utilizzato con successo per valutare l'impatto delle mutazioni del gene ASD nei moscerini21,41 e l'esposizione a sostanze chimiche 38,39. Molteplici avanzamenti e automazione nel saggio sono stati descritti prima del 16,41,42,43; In questo articolo, stiamo dimostrando il modello di analisi più semplice, che è facile da adottare e quantificare.
È noto che l'ASD influisce sulla capacità di assuefazione, apprendimento e memoria in alcuni pazienti 44,45,46,47,48,49,50, organismi modello ASD 51,52 e causa anche deficit in diversi comportamenti olfattivi50. L'abitudine al salto a luci spente di Drosophila è stata utilizzata in precedenza per lo screening dei geni ASD23. L'assuefazione può essere valutata con un semplice metodo di saggio di assuefazione olfattiva 53,54,55. Descriviamo il metodo per indurre l'assuefazione olfattiva e saggiamo il risultato utilizzando un classico saggio binario di scelta dell'odore basato sul labirinto a Y56 che può essere utilizzato per rilevare difetti nell'assuefazione in condizioni di mutazione del gene ASD o knockdown genico. Per valutare se l'impatto di una mutazione (o di un gene knock-down) o di un trattamento farmacologico sul comportamento di una mosca equivalga a un fenotipo ASD-like, si può utilizzare una combinazione di questi 5 saggi descritti qui.

<table><tbody><tr><td>Arena di aggressione:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra standard a 24 pozzetti in polistirene</td><td></td><td></td> trasparente <td>12 cm x 8 cm x 2 cm. Diametro di un singolo pozzetto = 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; profondità = 1 cm</td></tr><tr><td>Foglio</td><td></td><td></td> di plastica/acrilico trasparente <td>Alternativa: un coperchio perforato di una piastra per colture cellulari</td></tr><tr><td>Social Space Saggio:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clip</td><td></td><td></td> per legante <td>19 mm</td></tr><tr><td>Lastre di vetro e lastre acriliche di dimensioni</td><td></td><td></td> personalizzate <td>Spessore = 5 mm</td></tr><tr><td>Saggio di corteggiamento: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dado e bullone con filettatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fogli di perspex di forme personalizzate</td><td></td><td></td><td>i) Coperchio: un disco rotondo in perspex trasparente su misura (2-3 mm di spessore, 70 mm di diametro) con un foro di caricamento nella regione periferica e un altro foro per la vite al centro (diametro ~ 3 mm per ciascuno); ii) Un secondo disco di Perspex trasparente di spessore più spesso (3-4 mm di spessore, 70 mm di diametro), con 6-8 perforazioni di diametro 15 mm, equidistanti dal centro; iii) Base: Come il coperchio tranne che senza il foro di caricamento</td></tr><tr><td><forte>Saggio di toelettatura: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pannello</td><td></td><td></td> LED rivestito in vetro diffuso <td>10... Pannello LED montabile a soffitto da 15 Watt</td></tr><tr><td>Assuefazione e saggio del labirinto a Y</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camere rampicanti</td><td></td><td></td><td>x2, vetro borosilicato</td></tr><tr><td>Adattatore per il collegamento del labirinto a Y con fiala</td><td></td><td></td> d'ingresso <td>in Perspex, su misura, misurazioni in Figura 5A</td></tr><tr><td>Flaconi</td><td></td><td></td> di reagenti trasparenti <td>Borosil #1500017</td></tr><tr>Tappo <td></td><td></td><td>di lavaggio a gas</td><td>Borosil #1761021</td></tr><tr><td>Fiala</td><td></td><td></td> in vetro <td>OD= 25 mm x Altezza= 85 mm; Vetro borosilicato</td></tr><tr><td>Odorante (Butirrato di etile)</td><td></td><td></td><td>Merck #E15701</td></tr><tr><td>Cera di paraffina (liquida) light</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>Morsetti a</td><td></td><td></td> rullo <td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>Tubi</td><td></td><td></td> in silicone <td>OD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; morsetti a rullo per il controllo del flusso</td></tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td><td>a vuoto Hana #HN-648 (Qualsiasi pompa per acquario con direzione del flusso invertito manualmente)</td></tr><tr><td>Labirinto</td><td></td><td></td> a Y <td>Vetro borosilicato</td></tr><tr><td>Tubo di vetro a forma di Y (vetro borosilicato)</td><td></td><td></td><td>Su misura, misure in Figura 5A</td></tr><tr><td>Elementi comuni:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualsiasi software per la riproduzione video (es.- Lettore multimediale VLC)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>Computer per l'analisi video</td><td></td><td></td><td></td>dei dati</tr><tr><td>Bottiglie</td><td></td><td></td> Fly <td>OD= 60 mm x Altezza= 140 mm; vetro/polipropilene</td></tr><tr><td>Fiale</td><td></td><td></td> Fly <td>OD= 25 mm x Altezza= 85 mm; Vetro borosilicato</td></tr><tr><td>Graph-pad Prisma software</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Timer Videocamera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>con registrazione video impostata</td><td></td><td></td><td>La videocamera o la fotocamera di un telefono cellulare funzioneranno</td></tr><tr><td>Per aspiratore di mosche: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton</td><td></td><td></td><td>Absorbent, autoclavato</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich #P7793</td></tr><tr><td>Puntali</td><td></td><td></td> per pipette <td>200 &; L o 1000 &micro; L, scegliere in base al diametro esterno del tubo in silicone</td></tr><tr><td>Lunghezza del tubo</td><td></td><td></td> in silicone/gomma <td>= 30-50 cm. Il tubo deve essere inodore</td></tr><tr><td><forte>Composizione del cibo per mosche:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingredienti (quantità per 1 L di cibo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar (8 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)</td></tr><tr><td>Farina di mais (80 g)</td><td></td><td></td><td>D-glucosio biologico, procurato localmente</td></tr><tr><td>(20 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)</td></tr><tr><td>Acido propionico (4 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td></tr><tr><td>Saccarosio (40 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tego (Metil para idrossibenzoato) (1.25 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td></tr><tr><td>Lievito in polvere (10 g)</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>Fly lines utilizzato negli esperimenti in questo studio:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo selvatico (Cantone S o CS)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>w[1118]; fmr1[&delta; 50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*]; fmr1[&delta; 113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, consorzio NP, Japan</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di drosophila del disturbo dello spettro autistico

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi dello sviluppo neurologico con sintomi comportamentali comuni, tra cui deficit nell'interazione sociale e nella capacità di comunicazione, comportamenti limitati o ripetitivi migliorati e, in alcuni casi, difficoltà di apprendimento e deficit motorio. La Drosophila è servita come organismo modello senza pari per la modellazione di un gran numero di malattie umane. Poiché molti geni sono stati implicati nell'ASD, i moscerini della frutta sono emersi come un modo potente ed efficiente per testare i geni presumibilmente coinvolti nel disturbo. Poiché centinaia di geni, con vari ruoli funzionali, sono implicati nell'ASD, un singolo modello genetico di ASD è irrealizzabile; invece, singoli mutanti genetici, knockdown genici o studi basati sulla sovraespressione degli omologhi dei geni associati all'ASD sono i mezzi comuni per ottenere informazioni sui percorsi molecolari alla base di questi prodotti genici. In Drosophila sono disponibili una serie di tecniche comportamentali che forniscono una facile lettura dei deficit in specifiche componenti comportamentali. Il saggio dello spazio sociale e i saggi di aggressività e corteggiamento nelle mosche si sono dimostrati utili nella valutazione dei difetti nell'interazione sociale o nella comunicazione. Il comportamento di toelettatura nelle mosche è un'eccellente lettura del comportamento ripetitivo. Il test di assuefazione viene utilizzato nei moscerini per stimare la capacità di apprendimento dell'assuefazione, che risulta essere influenzata in alcuni pazienti con ASD. Una combinazione di questi paradigmi comportamentali può essere utilizzata per effettuare una valutazione approfondita dello stato di malattia umana simile all'ASD nei moscerini. Utilizzando le mosche mutanti Fmr1 , la ricapitolazione della sindrome dell'X fragile negli esseri umani e il knockdown delle file omologhe POGZ nei neuroni dei moscerini, abbiamo mostrato deficit quantificabili nel distanziamento sociale, nell'aggressività, nel comportamento di corteggiamento, nel comportamento di toelettatura e nell'assuefazione. Questi paradigmi comportamentali sono qui dimostrati nelle loro forme più semplici e dirette con l'ipotesi che ne faciliterebbero l'uso diffuso per la ricerca sull'ASD e altri disturbi dello sviluppo neurologico nei modelli di mosca.

Saggio di aggressione Come modello ASD a mosca, sono state utilizzate mosche mutanti Fmr1 63,64. w1118 maschi sono stati utilizzati come mosche di controllo e Fmr1 trans-eterozigote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 mosche maschi come mosche sperimentali; I maschi adulti sono stati alloggiati in tubi di isolamento per 5 giorni. I maschi omotipici (stesso genotipo, stesse condizioni di stabulazione) sono stati introdotti nell'arena dell'aggressività e il loro comportamento è stato registrato per 20 minuti. Per ogni genotipo è stato contato il numero totale di attacchi aggressivi in 20 minuti. Il numero di attacchi aggressivi durante i 20 minuti è risultato significativamente ridotto nel caso dei maschi mutanti rispetto ai maschi di controllo (Figura 1E). Questa ridotta aggressività nelle mosche Fmr1 potrebbe essere dovuta a un ridotto interesse per l'interazione sociale con un'altra mosca. Al contrario, i moscerini maschi mutanti Fmr1 di gruppo/socialmente ospitati mostrano un numero di attacchi di aggressività paragonabile a quello dei moscerini w1118 socialmente ospitati (dati non mostrati), indicando probabilmente un ruolo positivo dell'ambiente sociale nell'induzione del comportamento sociale.
Saggio dello spazio sociale Il saggio dello spazio sociale è stato eseguito in w1118 e mosche modello ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M ). Per ogni mosca è stata calcolata la distanza dal vicino più prossimo e sono state eseguite 10 repliche biologiche per ogni genotipo. I moscerini mutanti mostrano distanze significativamente più elevate rispetto alle controparti di controllo (Figura 2D), indicando una preferenza per una maggiore distanza dalle altre mosche.
Saggio di corteggiamento Il test di corteggiamento di mosche maschi alloggiate singolarmente è stato eseguito per quantificare il comportamento di corteggiamento innato di due mosche modello ASD separate. In primo luogo, il comportamento di corteggiamento delle mosche transeterozigoti Fmr1 è stato confrontato con quello di w1118; Le mosche Fmr1 hanno mostrato un indice di corteggiamento significativamente più basso e un numero ridotto di tentativi di copulazione (Figura 3E1). In un secondo esperimento, row, un ortologo di Drosophila del gene POGZ umano (un gene di rischio ASD20 altamente prevalente), è stato abbattuto esprimendo un microRNA a forcina corta contro row nei neuroni del corpo a fungo utilizzando la linea driver MB247-GAL4. Queste mosche modello ASD sono state testate per qualsiasi difetto nel modello di corteggiamento innato; L'indice di corteggiamento e il numero di tentati copulatori sono stati calcolati da video di 15 minuti. Le mosche knockdown hanno mostrato un indice di corteggiamento significativamente ridotto e un numero di tentativi di copulazione (Figura 3E2), indicando la loro comunicazione difettosa nei confronti delle femmine.
Comportamento di toelettatura Il comportamento di toelettatura viene utilizzato come lettura per il comportamento ripetitivo in Drosophila 16,42,43. Il comportamento di toelettatura è stato quantificato nelle mosche transeterozigoti Fmr1 e confrontato con quello di w1118. La latenza alla prima toelettatura è significativamente ridotta nei moscerini Fmr1, mentre la durata media dell'incontro di toelettatura e l'indice di toelettatura sono significativamente aumentati nei moscerini Fmr1 (Figura 4C), indicando un comportamento di toelettatura (o ripetitivo) migliorato nei moscerini modello ASD. Al contrario, il numero totale di attacchi di toelettatura nei moscerini mutanti non è risultato alterato in modo significativo rispetto a quello dei moscerini di controllo.
Saggio di assuefazione olfattiva L'assuefazione è difettosa in un gran numero di individui autistici e può essere utilizzata come test per lo stesso in Drosophila23. Qui, l'assuefazione olfattiva è stata testata nel modello ASD abbattendo la fila negli interneuroni locali olfattivi guidati da LN1-GAL4. Un odorante avversivo, il 20% di butirrato di etile, è stato utilizzato in questi esperimenti per indurre l'assuefazione in queste mosche. I risultati mostrano che le mosche knockdown non si sono abituate dopo un'esposizione di 3 giorni agli odori (le ultime due barre nel grafico nella Figura 5E non mostrano una differenza significativa tra mosche naive e abituate) rispetto alle mosche di tipo selvatico che mostrano un'assuefazione tipica dopo l'esposizione al butirrato di etile per 3 giorni (le mosche esposte mostrano un calo significativo dell'indice di prestazione rispetto alle mosche naïve). Ciò indica che le mosche knockdown non si abituano dopo l'esposizione al butirrato di etile per 3 giorni e sono respinte dall'odore ripugnante, dimostrando che queste mosche ASD sono carenti di assuefazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg"> Figura 1: Arena dell'aggressività e modelli comportamentali rappresentativi. (A) L'arena dell'aggressività allestita in una piastra a 24 pozzetti con un coperchio perforato per l'ingresso al volo. Riquadro: Dimensioni di una singola arena con cibo per mosche. (B) Fotografia di un tubo di stabulazione singola contenente una singola mosca maschio isolata e una fiala di gruppo contenente mosche maschili e femmine, ricapitolando un ambiente sociale. (C) Un aspiratore per il trasferimento di mosche basato sull'aspirazione orale. Elementi necessari per il montaggio di un aspiratore a mosca che indichi i lati del tubo per l'ingresso della mosca (estremità della mosca) e il lato che verrebbe inserito nella bocca (estremità della bocca) (C1) e un aspiratore a mosca assemblato (C2). (D) Modelli comportamentali aggressivi maschili rappresentativi: avvicinamento, minaccia alare, scherma, tenuta, affondo, boxe e zuffa. (E) I moscerini maschi mutanti Fmr1 mostrano un comportamento aggressivo ridotto nei confronti di altri maschi rispetto ai controlli. Box plot che mostra il numero di attacchi aggressivi per maschi socialmente isolati di w1118 (controllo) rispetto a mosche trans-eterozigoti Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg"> Figura 2: Allestimento dell'arena per saggi di spazi sociali. (A) Diagramma che mostra le dimensioni e la disposizione delle lastre di vetro e dei distanziatori acrilici. (B) La disposizione finale dei componenti dell'arena in cui i distanziatori acrilici sono inseriti tra i pezzi di vetro, lasciando un piccolo spazio per l'ingresso della mosca nella parte inferiore. Lo spazio triangolare creato tra pezzi di vetro e distanziatori è l'arena SSA per le mosche, qui le mosche sono in grado di muoversi solo in due dimensioni. (C) Fotografia dell'allestimento finale dell'arena SSA con le mosche all'interno della camera. Abbreviazione: SSA = array di spazio sociale. (D) I moscerini modello ASD (Fmr1 transeterozigote) mostrano una maggiore distanza l'una dall'altra nel test dello spazio sociale rispetto a w1118. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg"> Figura 3: Arena del corteggiamento e modelli comportamentali rappresentativi. Diagrammi che mostrano (A) il design e (B) la disposizione dei dischi in un'arena di saggio di corteggiamento. (C) Foto dell'arena di corteggiamento dopo l'arrangiamento finale. (D) Immagini rappresentative che mostrano i modelli comportamentali di corteggiamento di un maschio ingenuo nei confronti di una femmina accoppiata: inseguimento, orientamento, sfarfallio delle ali, leccamento, tentativo di copulazione e copulazione. (E) Grafici che mostrano l'indice di corteggiamento e il numero di tentate copulazioni in due modelli ASD: (E1) Le mosche mutanti Fmr1 mostrano una riduzione significativa dell'indice di corteggiamento e del tentativo di copulazione rispetto al controllo w1118 . (E2) le mosche knockdown di fila sono state utilizzate come un altro modello ASD in cui l'shRNA di fila era espresso nei neuroni del corpo del fungoy (MB247-GAL4); Una significativa riduzione del comportamento di corteggiamento è stata osservata dopo l'abbattimento della fila. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg"> Figura 4: Configurazione dell'arena e modelli comportamentali rappresentativi del comportamento di toelettatura. (A) L'arena a forma di disco o ruota (la stessa arena di corteggiamento mostrata nella Figura 3) è allestita su un pannello LED con un diffusore per un'illuminazione uniforme dal basso e il video è stato catturato dall'alto. Ciò garantisce un contrasto più elevato necessario per identificare il movimento fine delle appendici durante la toelettatura. (B) Fotografie dei modelli di comportamento di toelettatura osservati nei moscerini maschi adulti. T1 = 1° paio di gambe, T2 = 2° paio di gambe, T3 = terzo paio di gambe. La nomenclatura abbreviata intuitiva viene utilizzata per i modelli di toelettatura in B: T1-testa = testa strofinata con le prime zampe; T1-T1 = primo paio di zampe strofinate insieme, e così via. Abbreviazione: LED = diodo a emissione luminosa. (C) Grafici che mostrano i risultati del test di toelettatura eseguiti in mosche trans-eterozigoti Fmr1 e confrontati con w1118. I moscerini mutanti Fmr1 hanno mostrato una latenza significativamente ridotta per il primo incontro di toelettatura, indicando l'inizio precoce della toelettatura rispetto al controllo. Inoltre, la durata media dell'incontro di toelettatura e l'indice di toelettatura erano significativamente aumentati nei mutanti Fmr1 , indicativo di un comportamento ripetitivo migliorato nei moscerini modello ASD. Al contrario, il numero totale di attacchi di toelettatura non è stato alterato in modo significativo nei moscerini mutanti rispetto al controllo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg"> Figura 5: Induzione e configurazione del saggio per l'assuefazione olfattiva e l'esito rappresentativo dopo il saggio. (A) Componenti della configurazione del saggio binario per la scelta dell'odore: (A1) il labirinto a Y, (A2) l'adattatore, (A3) la disposizione di questi due, (A4) una coppia di provette di raccolta da attaccare alla sommità dei bracci del labirinto a Y, (A5) la bottiglia di vetro e i tubi di vetro per mantenere la soluzione odorizzante o l'acqua attraverso la quale l'aria bolle prima di passare al labirinto a Y. (B) Installazione di bottiglie di cibo per mosche per l'induzione dell'assuefazione olfattiva; il diagramma dei cartoni animati (B1) mostra come il tubo di microfuge contenente odorante sia appeso a un filo di rame a metà all'interno della bottiglia; (B2) infine, l'apertura della bottiglia viene coperta da cotone e sigillata da buste di carta marrone. (C) Foto della disposizione totale dell'allestimento del labirinto a Y. (D) Fotografie che mostrano la distribuzione delle mosche nelle camere di raccolta dopo la fine di un esperimento. (D1) Le mosche ingenue (esposte solo alla paraffina inodore, controllo) mostrano repulsione verso l'odorante avversivo (20% di butirrato di etile utilizzato per l'induzione dell'assuefazione in questo studio) e scelgono nel braccio del labirinto a Y riempito con aria normale mentre le mosche esposte (D2) (abituate) si distribuiscono uniformemente in entrambe le braccia. Abbreviazione: ID = diametro interno. (E) I risultati del test di assuefazione olfattiva delle mosche a fila hanno mostrato un difetto di assuefazione. Le mosche wild type (Canton S), dopo 3 giorni di esposizione al butirrato di etile, hanno mostrato una significativa riduzione dell'indice di prestazione rispetto alle mosche naïve, indicativa di assuefazione. Quando le progenie di mosche LN1-GAL4 x row-shRNA sono state esposte per 3 giorni, l'indice di prestazione non è risultato significativamente diverso da quello delle mosche naïve; ciò dimostra che queste mosche non si sono abituate dopo 3 giorni di esposizione all'odore, ricapitolando un sintomo umano simile all'ASD. Abbreviazioni: ASD = disturbo dello spettro autistico; shRNA = RNA a forcina corta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è associato a un comportamento sociale e comunicativo alterato e all'emergere di comportamenti ripetitivi. Per studiare l'interrelazione tra i geni ASD e i deficit comportamentali nel modello di Drosophila , in questo articolo vengono descritti cinque paradigmi comportamentali per valutare il distanziamento sociale, l'aggressività, il corteggiamento, l'adescamento e il comportamento di assuefazione.

Paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di Drosophila del disturbo dello spettro autistico

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

Il disturbo dello spettro autistico colpisce i bambini, portando a una compromissione della comunicazione, del comportamento sociale e di un aumento del comportamento ripetitivo. La Drosophila è un modello sempre più popolare per la ricerca sull'autismo per decifrare i percorsi molecolari sottostanti. Descriviamo un insieme di tecniche standard per la caratterizzazione comportamentale di modelli di autismo a mosca.Per decodificare le basi molecolari del disturbo dello spettro autistico nei moscerini, le sue manifestazioni comportamentali devono essere stabilite con precisione. Quantificare i tratti comportamentali umani dell'autismo in Drosophila melanogaster è un compito piuttosto impegnativo. Non esiste un unico paradigma comportamentale nelle mosche che affronti tutte le anomalie comportamentali di questo disturbo.Abbiamo descritto una serie di cinque paradigmi comportamentali ben consolidati in Drosophila, vale a dire, il saggio dell'aggressività, il saggio dello spazio sociale, la forma del mantello, la toelettatura e il saggio dell'assuefazione. Tutti questi possono essere utilizzati nei modelli di mosca ASD per caratterizzare e quantificare il livello di menomazioni nel comportamento comunicativo, nel comportamento ripetitivo e nel comportamento sociale. Abbiamo descritto queste cinque tecniche nella loro forma più semplice in modo che ogni laboratorio con una struttura di ricerca sulle mosche minima possa adottarle con facilità ed eseguire esperimenti su un modello di mosca del disturbo dello spettro autistico e contribuire all'avanzamento della nostra comprensione di questa malattia.

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