Name: Esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Scopri l'uso di un vettore di ossigeno a base di emoglobina polimerizzata (PolyHb) come soluzione di perfusione in un modello di polmone di ratto ex vivo. Questo metodo migliora la funzione polmonare e prolunga i tempi di perfusione normotermica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Avanzamento del trapianto di polmone con perfusione basata su polihHb nei modelli EVLP di ratto

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Siringa da insulina da 10 cc Ago da 29 G x 1/2"</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Bioreattore in batch di vetro da 30 L</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30 g Aghi</td><td>medici</td><td>BD-305106</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacina) Compresse antibatteriche</td><td>Elanco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10035-04-8</td> Per amplificatore a ponte di frequenza portante CFBA <td>lattato di Ringer</td></tr><tr><td>modificato tipo 672</td><td>Harvard Apparatus</td><td>731747</td><td></td></tr><tr><td>Connect kit D150</td><td>Cole-Parmer</td><td> VK 73-3763</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Medical #5/45 Pinze - Angolate 45 gradi</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline Star Edition 003, scaldabagno E100</td><td>Lauda</td><td>LCK 1879</td><td></td></tr><tr><td>Leucoriduzione umana scaduta, unità globuli rossi impaccate</td><td>Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiberoxygenator D150</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>PY2 73-3762</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Strumenti</td> <td>per le scienze fini11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide (C5H8O2 70 wt%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>111-30-8 (G7776)</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico Halsted-Mosquito</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-7112</td><td></td></tr><tr><td>Eparina 30.000 unità per 30 ml</td><td>APP Pharmaceuticals Albumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sierica umana (HSA)</td><td>OctaPharma Plasma</td><td></td><td>Additivo per perfusato</td></tr><tr><td>Set di tubi IL2 per perfusato</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>733842</td><td></td></tr><tr><td>IPL-2 Sistema di perfusione polmonare di base</td><td>Apparato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harvard Ketamina 500 mg per 5 ml</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannula dell'atrio sinistro</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>730712</td><td></td></tr><tr><td>Contattore a membrana Liqui-Cel serie EXF G420</td><td>3M</td><td>G420</td><td>contattore per gas</td></tr><tr><td>Soluzione di glucosio a basso contenuto di destrano di potassio (perfadex)</td><td>Soluzione XVIVO</td><td></td><td>per il lavaggio del polmone</td></tr><tr><td>Tubo rivestito in platino Masterflex (Dimensioni: 73,17,16,24)</td><td>Cole-Palmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina (NALC, C5H9NO3S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616-91-1 (A7250)</td>Per vasi Nalgene per <td>lattato di Ringer modificato</td></tr><tr><td>( 10L, 20L)</td><td>Nalgene</td><td></td><td>Recipienti di filtrazione</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>&nbsp; Ismatec</td><td> ISM 827B</td><td></td></tr><tr><td>PES, 0,65 &; micro; m Modulo TFF</td><td>Repligen</td><td>N02-E65U-07-N</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>polietersulfone (PES), 0,2 &micro; m Modulo TFF</td><td>Repligen</td><td>N02-S20U-05-N</td><td></td></tr><tr><td>Polisulfone (PS), 500 kDa Modulo TFF</td><td>Repligen</td><td>N02-P500-05-N</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Per PBS</td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>&nbsp; ADInstruments</td><td>730045</td><td></td></tr><tr><td>Cannula dell'arteria polmonare</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730710</td><td></td></tr><tr><td>Tubo della testa della pompa (Dimensioni: 73,17,16,24)</td><td>PharMed BPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube&nbsp; Unguento oftalmico</td><td>Dechra</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>SCP Servocontrollore per perfusione tipo 704</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>732806</td><td></td></tr><tr><td>Ventilatore per piccoli animali modello 683</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>55-000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5 (S271-10)</td><td>Per PBS e soluzione salina</td></tr><tr><td>Cianoboroidruro di sodio (NaCNBH3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>25895-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Ditionito di sodio (Na2S2O4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7775-14-6</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-73-2</td><td>Per lattato</td></tr> <tr><td>di Ringer modificatoLattato di sodio (NaC3H5O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>867-56-1</td><td>Per lattato di Ringer modificato</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7558-79-4</td><td>Per PBS</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7558-80-7</td><td>per PBS</td></tr><tr><td>SomnoSuite Sistema di anestesia per piccoli animali</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Modulo SS-MVG</td><td></td></tr><tr><td>Ratti Sprague-Dawley</td> Modulo amplificatore trasduttore <td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAM-A tipo 705/1</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>73-0065</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore trasduttore TAM-D tipo 705/2</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>&nbsp; 73-1793</td><td></td></tr><tr><td>Modulo di controllo del tempo TCM tipo 686</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>731750</td><td></td></tr><tr><td>Cannula tracheale</td><td>Apparecchio Harvard 733557</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Set di tubi per camera umida</td><td>Apparato Harvard</td><td>&nbsp; 73V83157</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per tubi</td><td>Cole-Parmer</td><td>IS 0649</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta #5 Dumostar</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>&nbsp; INS500085-A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta #5 in acciaio inossidabile, curva</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>IND500232</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta #7 Titanium</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td> </td><td></td>INS600187</tr><tr><td>Tygon E-3603 Tubo 2,4 mm ID</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>721017</td><td>linea perfusata che entra nel polmone</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Tubo 3,2 mm ID</td><td>Apparato Harvard 721019</td><td></td><td>linea perfusata che esce dal polmone</td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>VCM modulo di controllo del ventilatore tipo 681</td><td>Harvard Apparatus</td><td>731741</td><td></td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>A12176-01</td><td>Additivo perfusato</td></tr><tr><td>Xilazina 100 mg per 1 ml</td><td>di Akorn</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Exploring Alternative Perfusion Solutions Using Next-Generation Polymerized Hemoglobin-Based Oxygen Carriers in a Model of Rat Ex Vivo Lung Perfusion

La validazione del nostro perfusato a base di PolyhHb e, inoltre, la stabilità di questo perfusato per diverse ore, è dimostrata nella Figura 10. Durante la prima 1 ora, tutti i perfusi testati (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), a base di globuli rossi) hanno mostrato una leggera diminuzione di LA pO2 (Post pO2). Tuttavia, il perfusato a base di globuli rossi ha mostrato una diminuzione significativa a 1 ora rispetto al PolyhHb (p &lt; 0,05). Quando sono stati testati nelle ore successive, sia il PolyhHb che il perfusates di controllo avevano un pO 2 stabile di LA, mentre il PolyhHb aveva una tendenza non significativa (p &gt; 0,05) di pO2 più elevato (Figura 10A). Delta pO2, cioè la variazione del pO2 di LA da pO2 di PA, è nuovamente diminuita significativamente a 1 h nel gruppo perfusato di globuli rossi (p &lt; 0,05), mentre è rimasta stabile nel gruppo PolyhHb e Control perfusates con un trend non significativo (p &gt; 0,05) di pO2 più elevato nel gruppo PolyhHb (Figura 10B). Il pCO2 di LA era significativamente più basso nel perfusato di globuli rossi e nel perfusato di controllo rispetto al perfusato di PolyhHb dopo la prima ora (p &lt; 0,05), e questo si è mantenuto vero nelle ore successive quando si confrontavano il perfusato di polihHb e il perfusato di controllo (Figura 10C). Infine, il delta pCO2 (cioè la variazione della pCO2 LA da pCO2 PA) era significativamente aumentato nel perfusato RBC dopo 1 ora (p &lt; 0,05), e dopo diverse ore rimaneva stabile sia nel perfusato Polyhb che in quello di controllo (Figura 10D).
I dati fisiologici polmonari in tempo reale raccolti attraverso il software di acquisizione forniscono informazioni complementari ai livelli di gas perfusato (Figura 11). La resistenza vascolare polmonare (PVR) ha mostrato ancora una volta che il perfusato dei globuli rossi è aumentato significativamente nella prima ora (p &lt; 0,05). Nelle diverse ore rimanenti, sia il perfusatore PolyhHb che quello di controllo hanno avuto un PVR stabile e basso (Figura 11A). La variazione del peso polmonare è aumentata significativamente anche nel perfusato dei globuli rossi nella prima ora (p &lt; 0,05) ed è aumentata sia nel perfusato PolyhB che in quello di controllo nelle ore rimanenti con un peso leggermente superiore nel perfusato PolyhHb (Figura 11B). Infine, la compliance è diminuita significativamente nel gruppo RBC perfusato entro la prima ora (p &lt; 0,05), mentre c'è stata una diminuzione non significativa nel PolyhHb e nel Control perfusato (p &gt; 0,05), con PolyhHb che ha avuto la più alta compliance dopo 4 ore (Figura 11C).
In termini di successo e/o fallimento tecnico (Figura 12), è importante attirare l'attenzione su diversi aspetti. Nella Figura 12A, possiamo vedere il fallimento dell'allotrapianto dovuto a necrosi del lobo superiore destro dovuta a un possibile coagulo all'interno del sistema vascolare polmonare. Nella Figura 12B, notiamo anche un grave edema tissutale all'interno del lobo destro, che porta al fallimento sperimentale. Le figure 12C-E mostrano la corretta conservazione e l'aspetto dei tessuti nelle rispettive condizioni sperimentali. Infine, nella Figura 12F, possiamo vedere la conservazione ideale dei tessuti dopo il lavaggio con una soluzione di conservazione polmonare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig01.jpg"> Figura 1: Sintesi e purificazione di PolyhHb su scala pilota. (A) Bioreattore per polimerizzazione. (B) I processi di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) sono impostati in un frigorifero a 4 °C. (C) Primo piano del set-up parallelo di TFF per il lavaggio dei globuli rossi (RBC) e la purificazione dell'emoglobina (Hb). (D) Primo piano del sistema TFF in serie a due stadi per la purificazione di PolyhHb. I recipienti per gli stadi uno e due si trovano rispettivamente a sinistra e a destra dei filtri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica del circuito di perfusione polmonare ex vivo (EVLP). (A) Disegno schematico del circuito EVLP. (B) Posizionamento in vivo della cannula dell'arteria polmonare e della cannula atriale sinistra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig03.jpg"> Figura 3: Strumenti chirurgici utilizzati per la perfusione polmonare ex vivo . (A) Sutura di seta. (B) Pinze a punta fine (di media lunghezza). (C) Pinze a punta fine (lunghezza lunga). (D) Pinze curve a punta fine. (E) Forbici alla maionese. (F) Cannula tracheale. (G) Cannula dell'arteria polmonare (PA). (H) Cannula atriale sinistra (LA). (I) Divaricatori per gabbie toraciche. (J) Forbici a molla. (K) Pinze DeBakey. (L) Emostato. (M) Piccole forbici. (N) Piccola pinza curva a punta fine. (O) Ritiri Adson. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig04.jpg"> Figura 4: Posizionamento chirurgico ed esposizione della vena cava inferiore (IVC). (A) Posizionamento del ratto per l'approvvigionamento polmonare. (B) Esposizione dell'IVC infraepatico. (C) Incannulare l'IVC e iniettare eparina con un ago da 27G. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig05.jpg"> Figura 5: Incannulare la trachea con il tubo endotracheale (ET). (A) Iniziare tagliando la pelle della zona del collo. (B) Sezionare i muscoli della cinghia e il tessuto connettivo per esporre la trachea. (C) Praticare un'incisione trasversale sulla trachea anteriore tra gli anelli cartilaginei abbastanza grandi per il tubo ET. (D) Inserire il tubo ET nella trachea e fissarlo in posizione con una sutura di seta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig06.jpg"> Figura 6: Posizionamento della cannula dell'arteria polmonare. (A) Esposizione della cavità toracica per visualizzare il cuore e i polmoni. (B) Identificare l'AP e isolarlo. (C) Posizionamento di suture intorno al PA. (D) Taglio di un piccolo foro nel tratto di efflusso del ventricolo destro (RVOT) per la cannula PA. (E) Posizionamento corretto della cannula PA all'interno del PA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig07.jpg"> Figura 7: Lavaggio dei polmoni con soluzione di conservazione. (A) Collegamento della cannula di lavaggio alla cannula dell'arteria polmonare (PA). (B) Il liquido limpido dovrebbe fuoriuscire dall'atrio sinistro (LA). (C) Collegamento della cannula PA al circuito di perfusione polmonare ex vivo per garantire il flusso e il posizionamento corretti della cannula PA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig08.jpg"> Figura 8: Posizionamento della cannula atriale sinistra (LA). (A). Dilatare delicatamente l'anulus della valvola mitrale con un paio di pinze. (B) Posizionare liberamente una sutura di seta attorno al ventricolo sinistro (LV). Posizionare la cannula LA all'interno dell'atrio sinistro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig09.jpg"> Figura 9: Estrazione del blocco cuore-polmone. (A) Legatura dell'esofago sotto l'emostato. (B) La dissezione libera il blocco cuore-polmone dalla colonna vertebrale. (C) Sezionare liberare la trachea. (D) Collegamenti e posizionamento corretti della cannula per perfusione polmonare ex vivo (EVLP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig10.jpg"> Figura 10. Livelli di gas perfusato nel tempo. (A) Post pO2, cioè pO2 atriale sinistro (LA), in una perfusione di 4 ore. (B) Delta pO2, cioè la variazione del LA pO2 dall'arteria polmonare (PA) pO2 in una perfusione di 4 ore. (C) Post pCO2, cioè LA pO2, in una perfusione di 4 ore. (D) Delta pCO2, cioè la variazione del pO2 LA da pO2 PA in una perfusione di 4 ore. Il blu rappresenta il perfuso di PolyhHb, il nero rappresenta il perfusato di controllo (media standard di William) e il rosso rappresenta il perfuso a base di globuli rossi. N=6 per gruppo. Le barre di errore indicano la deviazione standard. La significatività è stata testata utilizzando un test T di Student ed è indicata con un *, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig11.jpg"> Figura 11. Dati fisiologici polmonari in tempo reale. (A) Resistenza vascolare polmonare (PVR) oltre 4 ore di riperfusione. (B) Variazione (indicata con Δ) del peso polmonare nel tempo. (C) Conformità oltre 4 ore di riperfusione. Il blu rappresenta il perfuso di PolyhHb, il nero rappresenta il perfusato di controllo (media standard di William) e il rosso rappresenta il perfuso a base di globuli rossi. N=6 per gruppo. Le barre di errore indicano la deviazione standard. La significatività è stata testata utilizzando un test T di Student ed è indicata con un *, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig12.jpg"> Figura 12: Risultati tecnici rappresentativi. (A) Fallimento dell'innesto a causa di infarto del lobo superiore destro. (B) Fallimento dell'innesto a causa di grave edema del lobo destro. (C) Canulazione e perfusione riuscite dell'allotrapianto polmonare con perfusato di globuli rossi. (D) Canulazione e perfusione riuscite dell'allotrapianto polmonare con perfusato di PolyhHb. (E) Canulazione e perfusione riuscite dell'allotrapianto polmonare con perfusato standard. (F) Conservazione ideale dei tessuti dopo il lavaggio con soluzione di conservazione dei polmoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig12large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Lung transplantation is hampered by the lack of suitable donors. Previously, donors that were thought to be marginal or inadequate were discarded. ...

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