Name: Rilevamento efficace delle cellule della popolazione laterale di Hoechst mediante citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Scopri metodi alternativi per l'eccitazione del colorante Hoechst 33342 mediante laser a 375 nm e 405 nm per la citometria a flusso. Questa tecnica migliora l'accessibilità e il rilevamento delle cellule della popolazione laterale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni a J.H. dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81800207). L'assistenza di Beckman Coulter, Inc. nel fornire supporto per la citometria a flusso e la calibrazione dei parametri è molto apprezzata. Ringraziamo Jiao Chen dello State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, e Yu Qi del Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, per la loro assistenza nell'acquisizione dei dati della citometria a flusso.

Gli esperimenti di questo studio hanno utilizzato un totale di 10 topi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane. Le operazioni sperimentali sono state condotte in conformità con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sichuan (#201609309). I materiali sperimentali e i parametri della citometria a flusso utilizzati in questo articolo sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Isolamento e raccolta di cellule di midollo osseo di topo
<ol><li>Eutanasia dei topi in stretta conformità con le linee guida istituzionali. Per indurre l'incoscienza nel topo, somministrare anestetici per inalazione iniziando con isoflurano al 2%, seguito da un aumento graduale del dosaggio fino al 5% di isoflurano fino alla cessazione della respirazione.</li>
	<li>Sezionare i topi nella sala chirurgica o nella cappa aspirante. Pulisci e sterilizza i topi con etanolo al 70%.</li>
	<li>Tagliare completamente la pelle e il muscolo della gamba con forbici affilate e sezionare i femori.</li>
	<li>Schiacciare delicatamente il femore con una bacchetta di macinazione in un mortaio e sciacquare le cellule del midollo osseo con DMEM fino a quando l'osso diventa bianco.</li>
	<li>Filtrare le cellule del midollo osseo ottenute con un filtro da 100 μm in provette da 15 mL. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e lisare i globuli rossi residui con 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi per 1 minuto a 4 °C. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, lavare nuovamente con mezzo DMEM.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 2 mL di soluzione di incubazione (terreno DMEM + 5% FBS), contare le cellule con un contatore automatico di cellule e regolare la concentrazione delle cellule a 1,0 x 106 cellule/mL con soluzione di incubazione.</li>
</ol>2. Colorazione cellulare
<ol><li>Integrare 2 mL di sospensione di cellule del midollo osseo da ciascun topo con 5 μg/mL di Hoechst 33342. Ad un'altra aliquota da 1 mL, aggiungere 100 μM di verapamil come controllo negativo.</li>
	<li>Incubare a bagnomaria a 37 °C per 90 min agitando delicatamente ogni 30 min.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, raffreddare le cellule con ghiaccio per 5 minuti e poi centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule in una soluzione di funzionamento a freddo (HBSS + 2% FBS). Centrifugare a 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet di cella risultante in 500 μl di soluzione di corsa per campione. Prima dell'analisi FCM, integrare le cellule con 2 μg/mL di ioduro di propidio (PI) e metterle su ghiaccio per circa 5 minuti.</li>
</ol>3. Citometria a flusso
NOTA: Per un riepilogo dei vari sistemi e configurazioni utilizzati, vedere la Tabella 1.
<ol><li>Calibrare i valori del coefficiente di variazione (CV) dei canali richiesti utilizzando le fluorosfere di controllo qualità giornaliero (QC) negli FCM ed eseguire test a campione dopo aver completato con successo il controllo di qualità.<ol><li>Seleziona il collegamento sul desktop del software e avvia il software.</li>
		<li>Selezionare Avvia controllo qualità/standardizzazione nel menu Controllo qualità/Standardizzazione per accedere all'esperimento Controllo qualità.</li>
		<li>Inserire la provetta del campione QC fluorospheres nel supporto della provetta.</li>
		<li>Selezionare Avvia per caricare il campione e iniziare a eseguire la procedura QC. Gli FCM sono pronti per l'uso dopo il superamento del controllo qualità.</li>
	</ol></li>
	<li>Eccita il colorante Hoechst 33342 degli stessi campioni con un laser a 355 nm, 375 nm e 405 nm, rispettivamente, per il rilevamento del rosso Hoechst nel canale 690/50 nm e del blu Hoechst nel canale 450/50 nm.<ol><li>Per creare un nuovo esperimento, scegliere Nuovo esperimento dal menu File, specificare il percorso del file e salvare l'esperimento.</li>
		<li>Seleziona Imposta canale nel menu Impostazioni. Selezionare la casella di controllo del segnale del canale (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), quindi aggiungere il nome del reagente nella colonna Etichetta (Y585: PI; V450: Blu Hoechst-405 nm; V660: rosso Hoechst-405 nm; NUV450: Blu Hoechst-375 nm; NUV660: blu Hoechst-375 nm; UV450: Blu Hoechst-355nm; UV660: Blu Hoechst-355 nm).</li>
		<li>Fare clic sulle icone Pseudo grafici a colori nell'area del tracciato per creare i grafici. Selezionare il nome di un asse per modificare il canale visualizzato.</li>
		<li>Fare clic su Aggiungi provetta nella schermata Provetta per creare nuove provette e modificarne i nomi.</li>
		<li>Selezionare Esegui per caricare il campione, visualizzare i grafici e stabilire i gate. Regolare le impostazioni di guadagno e soglia. Seleziona Registra per salvare i dati.</li>
	</ol></li>
	<li>Progettare la logica di impostazione del gate.<ol><li>Per il primo grafico, fare clic sull'asse X per selezionare FSC-W e fare clic sull'asse Y per selezionare FSC-A. Selezionare Polygon Gate per disegnare il gate A per cerchiare la singola cella ed escludere le celle aderenti (Figura 1A).</li>
		<li>Per il secondo grafico, fare clic sull'asse X per selezionare FSC-A e fare clic sull'asse Y per selezionare SSC-A. Selezionare Polygon Gate per disegnare il gate B per separare le celle non frammentarie ed escludere i detriti cellulari (Figura 1B).</li>
		<li>Per il terzo grafico, fare clic sull'asse X per selezionare PI-A e fare clic sull'asse Y per selezionare SSC-A. Selezionare il Polygon Gate per disegnare il gate D. Selezionare le celle vive che mostrano PI negativo (Figura 1C) e disegnare il gate C per ottenere le celle live.</li>
		<li>Per il quarto grafico bidimensionale, fare clic sull'asse X per selezionare Hoechst Red e fare clic sull'asse Y per selezionare Hoechst Blue. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico e selezionare Proprietà dal menu a discesa. Selezionare Formato lineare fo sia l'asse X che l'asse Y. Selezionare Polygon Gate per disegnare il gate SP per ottenere le celle SP (Figura 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Per valutare l'idoneità del campione, utilizzare 355 nm di un citometro a flusso specifico23 per il rilevamento delle cellule SP.</li>
	<li>Utilizzare contemporaneamente i laser da 355 nm (potenza laser: 20 mW) e 405 nm (potenza laser: 80 mW) per rilevare sia le celle di controllo (con aggiunta di verapamil) che le celle sperimentali.</li>
	<li>Acquisire segnali di fluorescenza ai canali 690/50 nm e 450/50 nm corrispondenti ai due laser. Osservare l'efficace stimolazione del colorante Hoechst 33342 con laser a 355 nm e 405 nm con cellule SP trasparenti (Figura 2B-C).</li>
	<li>Per gli stessi campioni, utilizzare i laser da 375 nm (potenza laser: 60 mW) e 405 nm (potenza laser: 80 mW) per il rilevamento cellulare.</li>
</ol>

Metodo di eccitazione laser alternativo per un facile rilevamento delle cellule della popolazione laterale

<ol><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li>
<li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li>
<li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li>
<li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+%27side+population%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li>
<li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li>
<li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+still+an+elusive+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).</li>
<li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+PTEN%2FmTOR%2FSTAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).</li>
<li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658(2021).</li>
<li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Abbiamo utilizzato il protocollo descritto per condurre tre esperimenti, con ogni prova che ha coinvolto 3-4 topi, per un totale di 10 topi. La percentuale di cellule SP variava dallo 0,05% allo 0,76%. È importante notare che sono state osservate variazioni individuali tra i topi. Abbiamo utilizzato quattro citometri a flusso per analizzare i campioni di Hoechst. Si è osservato che l'eccitazione del colorante Hoechst da parte di un laser da 20 mW 355 nm sulla nuova versione della citometria a flusso è equivalente a quella di un laser da 100 mW 355 nm sulla citometria a flusso vecchio stile. Questo fenomeno può essere attribuito alla variazione dei tipi di laser impiegati in entrambi i sistemi. La potenziale ragione dell'effetto osservato dei laser a 375 nm e 405 nm potrebbe essere attribuita alla notevole potenza di entrambi i laser in combinazione con l'utilizzo del rivelatore a fotodiodo a valanga (APD). Il canale rosso di Hoechst ha catturato la lunghezza d'onda lunga quasi rossa di 690 nm, dove l'efficienza di conversione fotoelettrica del tubo fotomoltiplicatore (PMT) era relativamente bassa. Tuttavia, l'APD ha dimostrato un'efficienza di conversione fotoelettrica circa dieci volte superiore a quella del PMT24. Pertanto, se combinati con laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm, i rivelatori APD distinguono in modo efficiente le celle SP. Il laser a 405 nm non solo rileva efficacemente le cellule SP, ma mostra anche una capacità superiore nel distinguere un sottoinsieme di popolazioni debolmente positive al rosso di Hoechst rispetto al laser a 355 nm.
La fase critica del protocollo consiste nell'utilizzare la citometria a flusso con un laser a 375 nm o un laser a 455 nm per rilevare le cellule con canali a 690/50 nm (rosso di Hoechst) e 450/50 nm (blu di Hoechst). Mentre la tecnica rileva le celle SP con laser a 375 nm e 405 nm invece del laser a 355 nm (laser tradizionale per l'analisi delle celle SP1), che sono più comuni negli FCM, sono necessari laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm. Questo porta ai limiti di questa tecnologia. L'importanza del metodo è quella di espandere la gamma di laser utilizzati per rilevare i coloranti Hoechst in modo che altri modelli di citometria a flusso possano essere utilizzati per la rilevazione delle cellule SP.

Le cellule della popolazione laterale (SP) vengono identificate mediante colorazione Hoechst 33342 e analizzate mediante citometria a flusso (FCM). Le cellule SP sono caratterizzate dal pompaggio del colorante fluorescente di DNA fuori dalle cellule attraverso il loro trasportatore 1,2 a cassetta legante l'ATP (ABC). Il metodo è stato originariamente stabilito per isolare le cellule staminali ematopoietiche (HSC) del midollo osseo murino1. Le cellule SP del midollo osseo sono state arricchite con una popolazione di HSCs caratterizzate da CD117+Sca-1+Lin-Thy1 a bassa espressione 3,4. Successivamente, il metodo è stato ampiamente utilizzato per isolare e arricchire le cellule staminali da altri tessuti, tra cui il muscolo cardiaco5, il fegato6, il polmone7, il rene8 e il proencefalo9. In particolare, il metodo è stato applicato per isolare le cellule staminali tumorali (CSC) nell'ultimo decennio. Le CSCs rappresentano una piccola popolazione di cellule che possiedono le proprietà di inizio del tumore, autorinnovamento, resistenza alla chemioterapia e potenziale metastatico10. Le CSC sono state inizialmente identificate nelle neoplasie ematopoietiche11 e successivamente osservate in vari tumori solidi come i carcinomi della prostata12, dell'ovaio13, dello stomaco14, della mammella15 e del polmone16. Nonostante la disponibilità di varie tecniche per l'identificazione delle CSC, la tecnica SP rimane una scelta privilegiata grazie alla sua ampia applicabilità su diversi tessuti e linee cellulari. Inoltre, è una tecnica preziosa che isola le CSC utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)16,17,18. I risultati sperimentali dimostrano che le cellule SP mostrano una pronunciata tumorigenicità e mostrano elevati livelli di espressione dei geni associati alle cellule staminali19,20. Il nostro precedente studio21 ha anche dimostrato che l'analisi trascrittomica di cellule SP isolate nel mieloma multiplo rivela un arricchimento delle vie di segnalazione associate alle cellule staminali, come la via del riccio. Nel frattempo, abbiamo eseguito analisi di arricchimento del pathway sui geni differenzialmente espressi nelle cellule SP della leucemia mieloide acuta22. I geni alterati sono stati arricchiti in percorsi correlati alle cellule staminali (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Abbiamo scoperto che 1 x 105 cellule SP potevano formare tumori nei topi BALB/c null22, mentre le cellule non-SP non potevano, indicando che le cellule SP avevano caratteristiche delle cellule staminali della leucemia. L'efficacia del metodo Hoechst SP nell'identificazione delle CSC è evidente.
Il protocollo Hoechst SP è stato perfezionato e migliorato attraverso il progresso della ricerca. Il protocollo prevede un controllo rigoroso della concentrazione del colorante, della densità cellulare, della temperatura e della durata di incubazione, della composizione del tampone e del valore del pH. I campioni cellulari preparati in conformità a questo protocollo sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica. A causa dell'eccitazione del colorante Hoechst con un laser UV a 355 nm e del rilevamento della sua emissione di fluorescenza utilizzando sia un filtro da 690/50 nm (Hoechst Red) che un filtro da 450/50 nm (Hoechst Blue), per la FCM è necessario un laser a 350 nm. Tuttavia, i laser a 350 nm non sono comunemente equipaggiati nella maggior parte degli FCM a causa del loro costo elevato. Quindi, abbiamo cercato di trovare un approccio alternativo per l'eccitazione del colorante per la rilevazione efficace delle cellule SP mediante citometria a flusso. In questo studio, è stata valutata la capacità dei laser a 375 nm e 405 nm di rilevare le cellule SP e confrontata con quella del laser a 355 nm. I nostri risultati dimostrano una notevole somiglianza tra le celle SP rilevate dai laser a 355 nm, 375 nm e 405 nm. Questi risultati suggeriscono che i laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm possono fungere da alternative fattibili al laser a 355 nm per il rilevamento di cellule SP. L'inclusione di ulteriori sorgenti luminose di eccitazione per Hoechst 33342 facilita l'uso di più modelli di citometria a flusso.

<table><tbody><tr><td>Contatore di celle automatico</td><td>Countstar</td><td>1M1200</td><td></td></tr><tr><td>Cell Filter(100 &micro; m)</td><td>BIOFIL</td><td>CSS-013-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosfere per il controllo di qualità giornaliero</td><td>Beckman Coulter</td><td>B5230</td><td></td></tr><tr><td>Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle con 4,5 g/L di glucosio (DMEM medio)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CVRC</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>CORNING</td><td>35-081-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Hyclone</td><td>SH30030.02</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento efficace delle cellule della popolazione laterale di hoechst mediante citometria a flusso

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

Le cellule della popolazione laterale (SP) vengono identificate mediante colorazione Hoechst 33342 e analizzate mediante citometria a flusso (FCM). Il metodo Hoechst SP viene utilizzato per l'isolamento di cellule staminali in base alle proprietà di efflusso del colorante dei trasportatori a cassetta legante l'ATP (ABC). Il metodo è stato inizialmente impiegato per l'identificazione e l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche (HSC), ma ora si è evoluto per concentrarsi principalmente sull'identificazione e l'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC). Il metodo di rilevamento tradizionale della FCM utilizza un laser a 355 nm per eccitare il colorante per rilevare le cellule SP. Attraverso questo studio, abbiamo identificato con successo approcci alternativi per l'eccitazione del colorante che possono sostituire efficacemente la rilevazione di cellule SP utilizzando un laser a 355 nm. Ciò si ottiene attraverso l'utilizzo di laser ad alta potenza da 375 nm o 405 nm. Ciò ci consente di esercitare una maggiore selettività nel rilevamento delle cellule SP piuttosto che limitarci esclusivamente alla citometria a flusso laser a 355 nm.

Nella Figura 2, il gruppo di controllo è stato trattato con verapamil, che blocca i trasportatori ABC nelle cellule staminali per prevenire l'eliminazione di Hoechst 33342. In tal modo, le cellule staminali del gruppo non-verapamil espellono Hoechst 33342 e formano una popolazione cellulare negativa nota come cellule SP. Il laser a 355 nm ha eccitato efficacemente il colorante Hoechst 33342, ottenendo una chiara osservazione delle cellule SP del midollo osseo (Figura 2A). Le celle SP degli stessi campioni rilevati dal laser a 355 nm e dal laser a 405 nm sono risultate sostanzialmente identiche (Figura 2D).
Dalla Figura 2 e dalla Figura 3, abbiamo visto che anche altri modelli di misuratori di portata non tradizionali possono identificare le celle SP. I risultati indicano che sia i laser a 375 nm che quelli a 405 nm hanno eccitato efficacemente Hoechst 33342 per ottenere celle SP (Figura 3A-B). Quando è necessario rilevare o isolare CSC o HSC, possiamo optare per un laser a 375 nm o 405 nm invece di un laser a 355 nm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig01.jpg"> Figura 1: Logica di impostazione del gate basata sulla citometria a flusso per il rilevamento delle cellule SP. (A) FSC-A e FSC-W sono stati utilizzati per escludere le cellule aderenti. Il gate A rappresenta il cluster a cella singola. (B) I parametri di FSC-A e SSC-A sono stati impiegati per la rimozione dei detriti cellulari. Il gate B rappresenta il cluster di celle non frammentario. (C) Sono state selezionate cellule vive che presentano ioduro di propidio (PI) negativo. Il gate C rappresenta il cluster di cellule vive. (D) I segnali di fluorescenza sono stati acquisiti attraverso i canali 690/50 nm (rosso di Hoechst) e 450/50 nm (blu di Hoechst). Il gate SP rappresenta il cluster di celle SP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig02.jpg"> Figura 2: Il laser ad alta potenza da 405 nm rileva le celle SP con la stessa efficacia del laser a 355 nm. (A) Il colorante Hoechst 33342 è stato eccitato dal laser a 355 nm di un citometro a flusso convenzionale per rilevare le cellule SP del midollo osseo. (B, C) Le cellule SP del midollo osseo sono state identificate dai laser a 355 nm e 405 nm dello stesso FCM. (D) Le cellule SP degli stessi campioni rilevati dal laser a 355 nm e dal laser a 405 nm sono risultate sostanzialmente identiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig03.jpg"> Figura 3: I laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm sono in grado di rilevare le celle SP. (A) Il laser ad alta potenza da 375 nm è in grado di rilevare le celle SP. (B) Le cellule SP del midollo osseo possono essere rilevate anche utilizzando i laser a 405 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Tipo di laser</td>
			<td>Lunghezza d'onda del laser (nm)</td>
			<td>Potenza laser (mW)</td>
			<td>Filtro rosso Hoechst (nm)</td>
			<td>Filtro blu Hoechst (nm)</td>
		</tr><tr><td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td>Gas argon</td>
			<td>355</td>
			<td>100</td>
			<td>692/75</td>
			<td>448/59</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">CytoFLEX LX</td>
			<td rowspan="2">Semiconduttore</td>
			<td>355</td>
			<td>20</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>CytoFLEX S</td>
			<td>Semiconduttore</td>
			<td>375</td>
			<td>60</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>CytoFLEX SRT</td>
			<td>Semiconduttore</td>
			<td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Riepilogo delle configurazioni del citometro a flusso.

Qui, dimostriamo che i laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm possono eccitare efficacemente Hoechst 33342 e fungere da valida alternativa al laser a 355 nm per il rilevamento di cellule di popolazione laterale (SP), ampliando così la gamma di laser disponibili nelle applicazioni di citometria a flusso.

Rilevamento efficace delle cellule della popolazione laterale di Hoechst mediante citometria a flusso

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

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