Estrazione e rilevamento di geosmina e 2-metilisoborneolo in acqua e pesci utilizzando sonde di estrazione assorbente ad alta capacità e GC-MS

[Narratore] In questo video dimostreremo il processo per l'estrazione e la rilevazione di geosmina e 2-metilisoborneolo da campioni di acqua e pesce utilizzando sonde di estrazione assorbente ad alta capacità e gascromatografia-spettrometria di massa, o GC-MS. La geosmina e il 2-metilisoborneolo sono composti organici volatili di origine microbica che si trovano in corsi d'acqua, stagni, pozzi o persino sistemi di acquacoltura a ricircolo. Questi composti odorosi possono conferire odori e sapori sgradevoli all'acqua e ai pesci in essa coltivati anche a concentrazioni estremamente basse. Qui vediamo uno scienziato che raccoglie l'acqua da un sistema di acquacoltura a ricircolo. I campioni di acqua di geosmina e 2-metilisoborneolo vengono raccolti in fiale di vetro marrone classificate per i COV senza lasciare aria nella fiala. Per fare ciò, immergere e tappare la fiala sott'acqua in modo che non rimangano bolle d'aria. Iniziamo preparando la nostra calibrazione e gli standard interni. Innanzitutto, preparare una soluzione madre etichettata come C1 aggiungendo 10 microlitri di geosmina e soluzione di 2-metilisoborneolo a una concentrazione di 100 microgrammi per litro a un matraccio tarato da 100 millilitri. Riempire il pallone fino al segno del volume con metanolo di grado LC/MS. Il risultato è una soluzione contenente ciascun analita a una concentrazione di 10 microgrammi per litro. Successivamente, gli standard di calibrazione vengono preparati aggiungendo volumi specificati della soluzione madre C1 ai matracci tarati da 100 millilitri e riempindoli a volume con acqua deionizzata. È importante preparare quotidianamente nuovi standard di taratura, poiché queste soluzioni sono estremamente deperibili. Per gli standard interni, creare la soluzione madre I1 aggiungendo 10 microlitri di 2-isopropil-3-metossipirazina, nota anche come IPMP, in un pallone tarato da un litro riempito con metanolo di grado LC/MS, ottenendo una soluzione madre di 10 milligrammi per litro. Quindi preparare una seconda soluzione I2 aggiungendo cento microlitri della soluzione madre I1 a un pallone tarato da cento millilitri e riempiendola con acqua deionizzata per ottenere una concentrazione di 10 microgrammi per litro. Iniziare posizionando un campione d'acqua in fiala da 20 millilitri nel vassoio del campione. Pesare 2,5 grammi di cloruro di sodio e aggiungerlo a ciascun flaconcino del campione. L'aggiunta di sale migliora il trasferimento di geosmina e MIB dall'acqua allo spazio di testa. Aggiungere cinque millilitri di campione d'acqua a ciascuna fiala e aggiungere 50 microlitri della soluzione standard interna I2. Tappare e sigillare ogni fiala subito dopo la preparazione per ridurre al minimo la perdita di analita. La fase successiva è l'estrazione dell'analita. Posizionare il vassoio del campione nel supporto del vassoio dell'autocampionatore e preparare il metodo dello strumento con le seguenti impostazioni chiave: Tempo di agitazione pre-campionamento a 10 minuti. Parametri di campionamento: Incubare a 65 gradi Celsius per 30 minuti con una velocità di agitazione di 400 giri/min. Assicurarsi che l'opzione Wash HiSorb probe sia abilitata per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. Desorbimento della sonda: Impostare per 15 minuti a 270 gradi Celsius. Impostazioni dello scaricatore di condensa: una temperatura di carico dello scaricatore di 25 gradi Celsius e una portata di otto millilitri al minuto. Una volta impostate queste impostazioni, avviare l'autocampionatore in combinazione con il metodo GC-MS per l'analisi dei campioni d'acqua. Per l'analisi dei tessuti di pesce, inserire una fiala da 20 millilitri per campione di pesce nel vassoio. Omogeneizzare il tessuto di pesce utilizzando un robot da cucina e pesare un grammo di tessuto omogeneizzato in ciascuna fiala. Aggiungere cinque millilitri di una soluzione satura di cloruro di sodio e aggiungere a ciascun campione 100 microlitri della soluzione standard interna I2. Tappare e sigillare immediatamente ogni flaconcino. Il metodo di estrazione per i campioni di pesce è simile a quello per l'acqua, ma con differenze fondamentali dovute alla natura ricca di lipidi del tessuto ittico. Queste differenze includono il tempo di agitazione pre-campionamento: impostato su 20 minuti. Temperatura di incubazione del campione: 80 gradi Celsius per 30 minuti con una velocità di agitazione di 400 giri/min. Assicurarsi che la funzione di lavaggio della sonda HiSorb sia abilitata. Una volta completati questi passaggi, eseguire l'autocampionatore insieme al metodo GC-MS per l'analisi dei campioni di pesce, gli stessi parametri GC-MS si applicano sia ai metodi dell'acqua che a quelli dei tessuti di pesce. Il GC è dotato di cinque colonne MS da 30 metri per 0,25 millimetri per 0,25 micron. Come gas di trasporto viene utilizzato un elio ultrapuro, con una portata di due millilitri al minuto. Il programma del forno inizia con una temperatura iniziale di 60 gradi Celsius mantenuta per tre minuti, seguita da una rampa di temperatura da 10 gradi Celsius al minuto a 100 gradi Celsius, quindi da 20 gradi Celsius al minuto a 190 gradi Celsius e da 30 gradi Celsius al minuto a 280 gradi Celsius con un tempo di mantenimento finale di due minuti. L'autonomia totale è di circa 16,5 minuti. Per la linea di trasferimento tra il GC e il MS, impostare la temperatura a 280 gradi Celsius con la sorgente ionica a 250 gradi Celsius e il quadruplo a 200 gradi Celsius. Nella modalità MS per la scansione, utilizzare un intervallo compreso tra 50 e 350 con rapporto massa/carica. Per il monitoraggio degli ioni selezionati, o SIM, utilizzare i seguenti ioni per la quantificazione e la conferma: IPMP, rapporto massa/carica 152 e 137. MIB, rapporto massa/carica da 95 a 107. E geosmina, rapporto massa/carica 112 e 55. Infine, rivedi sempre manualmente le selezioni dei picchi nel tuo software cromatografico per evitare errori. Questo protocollo delinea le fasi per la rilevazione della geosmina e del 2-metilisoborneolo in campioni di acqua e pesce utilizzando sonde di estrazione assorbente ad alta capacità e GC-MS. Seguendo attentamente queste istruzioni, i ricercatori possono garantire risultati accurati e affidabili nell'analisi della presenza di questi composti. La prima figura mostra l'effetto della temperatura di desorbimento della sonda sul carryover. Uno standard di laboratorio contenente geosmina e 2-metilisoborneolo a 20 nanogrammi per litro è stato analizzato a tre diverse temperature di desorbimento della sonda. Il pannello A fornisce le aree di picco medie per geosmina e MIB. Ogni sonda è stata successivamente desorbita altre due volte alla stessa temperatura iniziale per valutare il carryover. I risultati per la geosmina e il MIB sono mostrati rispettivamente nei pannelli B e C. Il riporto è espresso come l'area del picco come percentuale dell'area del picco iniziale. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard in tre repliche. I risultati indicano che una temperatura di desorbimento più elevata riduce al minimo il carryover senza compromettere la sensibilità. La Figura 2 rappresenta un confronto tra il recupero dei dati corretto e quello non corretto per gli standard analitici a 15 e 40 nanogrammi per litro utilizzando sonde PDMS per l'estrazione. I campioni sono stati corretti con l'uso di 2-isopropil-3-metossipirazina, o IPMP, come standard interno. Senza correzione, il recupero è stato significativamente inferiore, con correzioni a circa il 60% degli importi di picco noti. Una volta corretto, il recupero era vicino al 100%, dimostrando l'importanza di utilizzare standard interni per una quantificazione accurata. La Figura 3 confronta i dati di recupero per la geosmina a sinistra e il 2-metilisoborneolo a destra a 15 nanogrammi per litro utilizzando due tipi di sonde: solo PDMS e sonde a tripla fase, che includono PDMS, divinilbenzene e carbonio ad ampio spettro. Entrambi i tipi di sonde mostrano buone prestazioni, anche se le sonde solo PDMS hanno avuto tassi di recupero leggermente migliori. Alla luce di questo risultato e dei risparmi sui costi, le analisi future sono state condotte con sonde solo PDMS. La Figura Quattro mostra la regressione lineare delle curve di calibrazione per geosmin e MIB. L'intervallo solido rappresenta la geosmina con un valore R al quadrato di 0,9999 e la linea tratteggiata rappresenta MIB, anch'essa con un valore R al quadrato di 0,9999. Entrambe le curve dimostrano un'eccellente linearità con un errore minimo, convalidando l'accuratezza quantitativa del metodo nell'intervallo di concentrazione testato. La figura cinque illustra le concentrazioni di geosmina e 2-metilisoborneolo in campioni d'acqua prelevati da sette diversi sistemi di acquacoltura. Il pannello A mostra le concentrazioni di geosmina e il pannello B mostra le concentrazioni di MIB. Ogni sistema aveva almeno tre repliche e, nella maggior parte dei casi, le concentrazioni di questi composti erano superiori ai limiti di rilevamento del metodo. Un sistema, etichettato come sistema uno, ha superato la soglia di odore umano per la geosmina, evidenziando un potenziale problema con la qualità dell'acqua in quel sistema. La Figura 6 fornisce i dati di due campioni di pesce, etichettati F1 e F2, che sono stati addizionati con geosmina e 2-metilisoborneolo. Entrambi i composti sono stati analizzati in triplicato per determinare il recupero e la precisione. Vengono tracciate le concentrazioni di geosmina e MIB e i campioni di pesce addizionati, dimostrando la capacità del metodo di rilevare con precisione questi composti anche in tessuti di pesce ricchi di lipidi. I metodi descritti oggi forniscono un quadro solido per la rilevazione sensibile della geosmina e del 2-metilisoborneolo. Grazie all'integrazione di sonde di estrazione assorbente ad alta capacità e di un'analisi GC-MS precisa, abbiamo dimostrato una tecnica che migliora significativamente le nostre capacità di rilevamento. Questo progresso metodologico non solo migliora la produttività, ma riduce anche il rischio di errore umano e aumenta la riproducibilità dei risultati. Man mano che continuiamo a perfezionare queste tecniche, diventeranno senza dubbio strumenti indispensabili nel campo del monitoraggio ambientale e della valutazione della qualità degli alimenti.