Un modello murino immunocompetente per la terapia termica interstiziale laser del glioblastoma

La nostra ricerca si concentra sui tumori cerebrali dell'adulto. Ciò include il glioblastoma, il glioma primario e le metastasi cerebrali. Abbiamo sviluppato modelli murini di tumore cerebrale per identificare trattamenti più efficaci per i pazienti con queste condizioni fatali.

Il glioblastoma è il tumore cerebrale primario più grave e più frequente. In oltre il 20% dei pazienti con glioblastoma, questo tumore cerebrale non può essere rimosso chirurgicamente. In questi casi, la Terapia Termale Interstiziale Laser, in breve LITT, viene utilizzata clinicamente per colpire questi tumori cerebrali aggressivi.

La LITT è una tecnologia di ablazione termica dei tessuti che viene applicata clinicamente per i tumori cerebrali chirurgicamente inaccessibili. La nostra ricerca che utilizza modelli murini LITT fornirà importanti informazioni sulle risposte tissutali e cellulari al trattamento termico nel tumore e nel tessuto cerebrale circostante. Una migliore comprensione dei cambiamenti molecolari e cellulari causati dalla LITT nel cervello ci consentirà di utilizzare la LITT in modo più efficace per migliorare i risultati per i pazienti con tumore cerebrale.

La sfida sperimentale più critica è il targeting e il trattamento accurati del tumore. A differenza della chirurgia LITT, utilizzata clinicamente nei pazienti umani, la maggior parte dei modelli non dispone di risonanza magnetica in tempo reale, rendendo difficile il targeting del tumore senza alcun aiuto visivo. Per iniziare, registrare il peso del topo anestetizzato per calcolare il corretto dosaggio del farmaco.

Radere accuratamente l'area chirurgica, evitando gli occhi, le orecchie e i baffi. Posizionare gli incisivi del mouse nel foro della barra del morso e regolare il cono del naso di un telaio stereotassico finché non si adatta perfettamente, quindi serrare la vite di fissaggio per fissarlo in posizione. Controllare la profondità dell'anestesia eseguendo pizzicamenti bilaterali delle dita dei piedi degli arti posteriori.

Una volta che il mouse è stato adeguatamente anestetizzato, fissare il cranio utilizzando i perni auricolari e regolare la testa in una posizione neutra e piana. Applicare abbondantemente l'unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Utilizzando una siringa da 28 pollici di calibro, iniettare meloxicam per via sottocutanea come antidolorifico.

Ridurre la frequenza anestesiologica per mantenere la frequenza respiratoria target. Quindi, drappeggia asetticamente il topo. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, applicare la soluzione disinfettante alla clorexidina iniziando medialmente e procedendo verso l'esterno.

Quindi, utilizzando un batuffolo di cotone sterile fresco, applicare il 70% di etanolo allo stesso modo. Ricontrollare la profondità dell'anestetico monitorando la frequenza respiratoria. Quindi, utilizzando un bisturi a lama numero 15, praticare un'incisione sagittale centrale da 1,0 a 1,5 centimetri iniziando leggermente posteriormente agli occhi nella direzione della coccola.

Ora, usando un batuffolo di cotone sterile, rifletti i bordi della ferita per visualizzare il cranio. Strofinare delicatamente il tessuto connettivo dall'area. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di perossido di idrogeno per esporre la superficie del cranio e visualizzare le suture lambda.

Localizzare il bregma nel punto in cui le suture corneali sinistra e destra incontrano la sutura sagittale. Opzionalmente per facilitare il trasferimento del bregma durante l'intervento chirurgico LITT, utilizzare una resina acrilica colorata atossica e uno stuzzicadenti di legno sterile e fare un piccolo segno sul bregma. Con la siringa da microlitro nel telaio, azzerare le coordinate stereotassiche con la punta a contatto con il bregma.

La coordinata X si riferisce al movimento nel piano laterale mediale, la coordinata Y per il movimento antero-posteriore e la coordinata Z per il piano ventrale dorsale. Assicurarsi che lambda si trovi sullo stesso piano ventrale dorsale di bregma, dove Z è uguale a zero in entrambi i punti di riferimento. Se sono necessarie regolazioni, assicurarsi che il cranio sia ancora fissato saldamente applicando una leggera pressione con un tampone sterile.

Posizionare la punta dell'ago sull'area target alle coordinate più 2,0 millimetri media laterale e più 0,5 millimetri anteroposteriore da bregma. Abbassare con cautela la punta del trapano finché non tocca il cranio. Sollevare leggermente la punta dell'ago e fare un piccolo punto nella posizione del foro della fresa usando un pennarello chirurgico sterile.

Quindi, solleva leggermente l'ago in modo che non sia d'intralcio e pratica un foro nella posizione contrassegnata, facendo attenzione a sbavare solo attraverso il cranio senza danneggiare le meningi sottostanti. Creare un secondo foro di fresatura a più 3,0 millimetri lateralmente mediale e più 0,5 millimetri anteroposteriore, oppure estendere il foro originale a questa coordinata per accogliere la termocoppia durante la procedura LITT. Quindi, rimuovere la provetta da microcentrifuga contenente le cellule di glioma di topo CT2A dal ghiaccio e muovere delicatamente la provetta con la punta di un dito per risospendere le cellule.

Utilizzando una siringa da cinque o 10 microlitri, aspirare delicatamente circa due microlitri di sospensione cellulare. Estrarre 0,5 microlitri dalla siringa per rimuovere l'aria. Pulire l'asta dell'ago con un tampone imbevuto di alcol per rimuovere eventuali residui di liquido o cellule.

Abbassare lentamente l'ago a una profondità di Z pari a meno tre millimetri e fare una pausa di un minuto. Quindi ritrarre lentamente l'ago di 0,5 millimetri e iniettare le cellule a una velocità di 0,5 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, attendere due minuti prima di ritrarre lentamente la siringa nell'arco di tre o quattro minuti.

Fermarsi fino a un minuto dopo i primi intervalli da 100 a 250 micrometri aiuterà a prevenire lo spostamento delle cellule. Per chiudere l'incisione della ferita, riapprossimare i bordi dell'incisione. Utilizzando tre punti interrotti con una sutura a 50, chiudere la ferita mentre estroflesse leggermente i bordi della ferita per garantire che il derma sottostante si tocchi.

Applicare la soluzione di iodio povidone sulla ferita chiusa e trasferire il mouse in una gabbia di recupero rivestita di carta su un cuscinetto riscaldante impostato a 37 gradi Celsius. Una volta che l'animale ha riacquistato la decubito sternale, può essere trasferito di nuovo nella sua gabbia di origine. Nove giorni dopo l'iniezione della sospensione di cellule di glioma di topo CT2A, fissare il topo anestetizzato nel telaio stereotassico.

Ricrea un'incisione sulla linea mediana e usa un tampone di cotone sterile per pulire il cranio e rimuovere qualsiasi tessuto che oscura il bregma. Con la Terapia Termale Interstiziale Laser o l'attacco LITT in posizione sul telaio stereotassico, azzerare le coordinate alla bregma per la punta della fibra laser. Quindi, solleva leggermente la punta della fibra laser e spostati sulle coordinate laterali e posteriori mediali desiderate.

Quindi abbassare lentamente la sonda fino alla coordinata ventrale dorsale del bersaglio per arrivare al bersaglio. Impostare i parametri del trattamento LITT in modalità continua e alimentare uno cosa. Quindi, passare dallo standby all'attivo del laser e attivare il laser per 60 secondi utilizzando il pedale.

Se la temperatura supera i 46 gradi Celsius, fare una breve pausa, quindi riattivare, con l'obiettivo di mantenere la temperatura vicina ai 46 gradi Celsius. Infine, ritrarre lentamente il gruppo laser. Pulire delicatamente la fibra laser e la termocoppia con un tampone imbevuto di alcol.

Ruotare il gruppo in modo che non sia d'intralcio, assicurandosi che le sonde non entrino in contatto con il telaio. Le immagini di risonanza magnetica cornale pesate in T2 hanno mostrato il successo dell'impianto del tumore con tassi di prelievo quasi del 100% e una formazione costante di tumori sferici. Il trattamento con LITT ha portato ad ablazioni coerenti con aree nere iperintense definite, che indicano necrosi tissutale nel nucleo centrale e un'area bianca iperintensa circostante che mostra edema perioperatorio.