Isolamento basato sulla citometria a flusso e valutazione terapeutica dei linfociti infiltranti il tumore in un modello murino di carcinoma pancreatico

Ci concentriamo sullo sviluppo di un metodo per isolare e trasferire in modo adottivo i linfociti infiltranti il tumore, TIL, in un modello di cancro al pancreas. Stiamo cercando di rispondere se i sottogruppi di TIL possono colpire e uccidere efficacemente i tumori pancreatici in vivo e come le cellule T possono essere ottimizzate per futuri studi clinici. Recenti sviluppi nella terapia cellulare adottiva, tra cui il miglioramento delle tecniche di isolamento ed espressione del TIL, la modifica delicata dei TIL per migliorarne il targeting e la combinazione della terapia TIL con altre immunoterapie come gli inibitori del checkpoint o le terapie mirate per una maggiore efficacia antitumorale.

Abbiamo stabilito un metodo robusto per isolare ed espandere i TIL reattivi al tumore da un modello murino di cancro al pancreas. Abbiamo dimostrato una maggiore efficacia antitumorale delle cellule T reattive al tumore trasferite in modo adottivo. Il nostro protocollo offre un approccio più mirato alla terapia cellulare adottiva, consentendo l'isolamento e la selezione di TIL tumore-specifici rispetto ad altri metodi meno specifici.

Viene utilizzato anche mediante imaging bioluminescente per il monitoraggio non invasivo dei tumori. I nostri risultati faranno avanzare il campo fornendo un modello preclinico standardizzato per valutare l'efficacia della terapia TIL e ottimizzare i parametri di trattamento dei sottogruppi di cellule T per il cancro del pancreas. Per preparare una sospensione cellulare di KPC-Luciferasi per indurre un tumore pancreatico ortotopico nei topi, tripsinizzare la linea cellulare di KPC-Luciferasi per un minuto a 37 gradi Celsius.

Dopo la tripsinizzazione, aggiungere PBS, trasferire le cellule e quindi centrifugare la sospensione cellulare. Contare le cellule e risospenderle ad una concentrazione di 1 x 10 alla potenza di 6 cellule per millilitro in PBS contenente il 30% di matrice di membrana basale. Posizionare il mouse anestetizzato su una piattaforma operativa.

Dopo aver praticato un'incisione addominale sinistra da 0,5 a 1 centimetro, tenere la milza con una pinza ed esporre il pancreas. Dopo aver preparato la miscela di cellule KPC-Luciferasi e matrice della membrana basale, iniettare 50 microlitri della sospensione cellulare contenente 50.000 cellule nel pancreas utilizzando un ago calibro 29. Rimetti il pancreas nella cavità addominale.

Suturare in sequenza il peritoneo e la pelle. Lasciare che il mouse si riprenda su un pad caldo fino a quando non è completamente sveglio. Dopo sette giorni, iniettare intraperitonealmente nel topo 60 microlitri di soluzione di sale di potassio D-Luciferina per l'imaging dal vivo.

Dopo l'anestesia, posizionare il mouse nel sistema di imaging in vivo per il rilevamento della bioluminescenza. Dopo l'imaging, rimuovere il mouse dal sistema e lasciarlo riprendersi naturalmente dall'anestesia. Per iniziare, posiziona il topo soppresso del donatore su una piattaforma operativa.

Sterilizzare l'intero corpo con etanolo al 75%. In un cappuccio sterile, usa forbici e pinze per aprire la cavità addominale. Rimuovere il tumore e metterlo in PBS su ghiaccio.

Misurare la dimensione del tumore con un calibro a corsoio. Quindi, calcola il volume del tumore utilizzando la formula sullo schermo. Dopo aver preparato la soluzione di digestione 1X utilizzando collagenasi, Dispasi II e DNAsi I in RPMI 1640, aggiungere da uno a due millilitri di soluzione per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti.

Tritare i tumori in piccoli pezzi usando le forbici. Trasferire i pezzi di tumore in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e digerirli a 37 gradi Celsius agitandoli a 70 giri/min per 30 minuti. Per terminare la digestione, aggiungere uno o due millilitri di siero fetale bovino al 10% e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di raccolta.

Lavare due volte i pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con PBS per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micrometri, tritare e frantumare i frammenti di tessuto per rilasciare le singole cellule utilizzando l'estremità piatta di uno stantuffo della siringa. Centrifugare il filtrato a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in albumina sierica bovina al 5% per la colorazione con citometria a flusso.

Per iniziare, posizionare le cellule isolate dal topo portatore di tumore insieme alla milza o alle cellule mononucleate del sangue periferico dal topo non portatore di tumore su una piattaforma di lavoro. Colorare le cellule con bloccanti FC e anticorpi di flusso a una diluizione da 1 a 100. Incubare le provette su ghiaccio al buio per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte in PBS mediante centrifugazione prima di risospenderle in albumina sierica bovina all'1% in PBS. Su un citometro a flusso, per selezionare le cellule CD45+CD3+, eseguire il gate delle cellule vive in base a FSC-A e SSC-A per creare il gate P1. Quindi, eseguire il gate delle singole celle da P1 in base a FSC-A e FSC-H per creare il gate P2. Ordina le cellule CD45+CD3+ da P2 utilizzando il gating CD45 e CD3. Raccogliere le cellule ordinate in provette di raccolta.

La centrifuga ha selezionato le cellule CD45+CD3+ a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere le cellule nel siero di topo a una concentrazione di 1 volte 10 alla potenza di 6 cellule per millilitro e metterle sul ghiaccio. Posizionare il topo ricevente indotto dal tumore su una piattaforma operativa.

Utilizzando una siringa da insulina da 29 gauge da 1/2 pollice, iniettare intraperitonealmente le cellule immunitarie selezionate. Quindi, somministrare l'interleuchina-2 per via intraperitoneale per tre giorni consecutivi.