Un sistema microfisiologico cardiaco per lo studio della propagazione del Ca²⁺ tramite stimolazione ottica non genetica

La ricerca mira a far progredire i modelli microfisiologici cardiaci in vitro integrando metodi di fotostimolazione basati su materiali. Si concentra sul superamento dei limiti di longevità e invasività della stimolazione, fornendo strumenti affidabili per lo studio della fisiologia cardiaca, migliorando i processi di screening dei farmaci e promuovendo applicazioni nella modellazione delle malattie. I recenti progressi nella biostimolazione fanno leva, ad esempio, per un controllo cellulare preciso e non invasivo.

L'optogenetica consente alla modificazione genetica di regolare l'attività cellulare, mentre i fototrasduttori emergenti basati su materiali offrono alternative non genetiche. Questa innovazione rappresenta un significativo passo avanti nello studio e nella modulazione di neuroni, cardiomiociti e cellule muscolari scheletriche in diverse applicazioni. Le attuali sfide sperimentali includono il raggiungimento di un'erogazione costante della luce ai tessuti profondi, l'ottimizzazione della biocompatibilità e della stabilità dei fototrasduttori e il miglioramento della precisione delle tecniche di stimolazione basate sulla luce.

Inoltre, l'integrazione di questi metodi con sistemi biologici complessi, mantenendo al contempo la vitalità e la funzionalità cellulare, rimane un ostacolo fondamentale. Questo protocollo affronta il divario di ricerca della necessità di tecniche di stimolazione precisa non invasive in modelli microfisiologici cardiaci. Utilizzando fototrasduttori basati su materiali, come Ziapin2, questo approccio supera i limiti della stimolazione elettrica tradizionale e dell'optogenetica, offrendo un migliore contorno temporale e spaziale preservando la vitalità e la funzione dei tessuti.

I miei risultati faranno avanzare la ricerca introducendo una tecnica di stimolazione della luce non invasiva basata su materiali che offre maggiore precisione e controllo sull'attività cellulare nei tessuti cardiaci. Questo approccio elimina la necessità di modifiche genetiche, fornendo uno strumento versatile per modellare la funzione cardiaca, studiare i meccanismi della malattia e sviluppare strategie terapeutiche più efficaci. Per iniziare, far aderire due strati di nastro da laboratorio, uno bianco e uno blu, su una lastra acrilica trasparente, resistente ai graffi e ai raggi ultravioletti di un millimetro di spessore.

Tagliare il motivo del chip sul nastro secondo il design previsto, quindi, utilizzando un incisore laser ad anidride carbonica, tagliare il foglio acrilico in cerchi. Rimuovere i due strati di nastro adesivo all'interno della linea più interna utilizzando una pinzetta. Immergere le patatine in candeggina pura per 30 minuti a un'ora per rimuovere le linee spesse e le macchie scure dal taglio, lasciando una linea nitida, e sciacquare le patatine in un bicchiere con acqua corrente deionizzata durante la notte o per almeno tre ore.

Sonicare i chip per 10 minuti nei timbri in polidimetilsilossano, o PDMS, con le caratteristiche della scanalatura della linea per 30 minuti in etanolo pulito al 70%. Trasferisci le patatine e i timbri in un'area pulita sotto una cappa e lasciali asciugare sotto il flusso d'aria per circa una o due ore. Quindi, sonicare la gelatina appena preparata per 15 minuti, quindi rimetterla a bagnomaria a 65 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Posizionare la transglutaminasi microbica, o provetta MTG, in un essiccatore con il tappo leggermente allentato e accendere lentamente il vuoto per rimuovere le bolle. Dopo il degasaggio, riportare il tubo MTG a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi, coprire un foglio di griglia con Parafilm pulito e posizionare le patatine sulla griglia.

Tenere il timbro PDMS nelle vicinanze per l'uso. Aggiungere cinque millilitri di MTG a cinque millilitri di soluzione di gelatina, pipettando accuratamente per evitare bolle. Ora, aliquote rapidamente circa 0,5 millilitri della miscela di gelatina su ogni chip, assicurandosi che la miscela copra l'area del chip.

Posizionare il timbro PDMS a linee sulla parte superiore e applicare un peso di 200 grammi per assicurarsi che la gelatina sia modellata parallelamente all'asse longitudinale del tessuto. Una volta che tutte le patatine sono state modellate, copritele con un barattolo di vetro per evitare disturbi ambientali e lasciatele reticolare durante la notte. Trasferire il chip e il timbro PDMS inseriti in un nuovo piatto P150 riempito di PBS per idratare la gelatina per 30 minuti a un'ora per facilitare la separazione del timbro PDMS dal chip.

Dopo aver rimosso la gelatina in eccesso, sformare la patatina attorno al chip, trasferire il chip pulito in un nuovo piatto P150 riempito di PBS. Conservare i timbri PDMS in etanolo al 70%. Per sterilizzare le patatine, immergerle in etanolo per 10 minuti sotto la cappa.

Trasferisci le patatine su PBS, immergile per 10 minuti, seguite da un lavaggio PBS tre volte. Per le soluzioni di rivestimento, miscelare 20 microgrammi per millilitro di fibronectina con una diluizione da uno a 100 di Geltrex in terreni di coltura senza integratori. Rivestire i chip con questa soluzione per due ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Scongelare e seminare cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in terreno RPMI contenente 10 micromolari di Y-27632. Sostituire il supporto con RPMI privo di Y-27632 dopo 24 ore. Tre giorni dopo la semina delle cellule, usa una pinzetta per rimuovere con cura il nastro bianco dalle schegge.

Preparare l'apparato di mappatura ottica costituito da un microscopio con lenti tandem modificato dotato di una fotocamera ad alta velocità e una lampada al mercurio da 200 milliwatt come sorgente luminosa di eccitazione. Posizionare uno specchio dicroico davanti alla telecamera per l'imaging del calcio designata. Per la stimolazione ottica, applicare la stimolazione ottica puntiforme a un'estremità del tessuto utilizzando una sorgente luminosa a LED per stimolare Ziapin2, il fototrasduttore.

Regolano i tessuti a una frequenza di 0,5, o un hertz, tramite una fibra ottica temporalmente regolata posizionata a un millimetro di distanza dal tessuto. Incubare il campione con due micromolari X-Rhod-1 aggiunti al terreno di coltura per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato le patatine con terreno di coltura fresco, trasferirle in terreno RPMI 1640 privo di rosso fenolo, integrato con B-27 meno insulina e HEPES.

Posiziona i chip di tessuto in un piatto a temperatura controllata impostato su una temperatura fisiologica e avvia le registrazioni a una frequenza di fotogrammi di 2,5 fotogrammi al secondo. La propagazione delle onde di calcio è stata visualizzata con successo, con una chiara risoluzione spaziale e temporale durante la fotostimolazione a frequenze di 0,5 o un hertz, con velocità di conduzione calcolate come circa 4,5 centimetri al secondo, coerenti con i valori fisiologici. I parametri transitori del calcio, tra cui l'ampiezza, il tempo di salita, il decadimento massimo, la pendenza e il tempo di decadimento, erano quantitativamente simili tra la stimolazione luminosa e la stimolazione elettrica, confermando risposte funzionali comparabili.