Name: Approccio transcongiuntivale per liniezione nel nervo ottico del ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: Impara l'approccio transcongiuntivale per l'iniezione nel nervo ottico del ratto. Questa tecnica minimamente invasiva migliora la somministrazione terapeutica nella ricerca sulla neurofibromatosi di tipo 1.

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<ol><li>Korn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+neuroprotective+effects+of+methylprednisolone+and+surgical+decompression+in+a+rodent+model+of+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the neuroprotective effects of methylprednisolone and surgical decompression in a rodent model of traumatic optic neuropathy.</a> Curr Eye Res. 47 (3), 461-467 (2022).</li>
<li>Lim, J. Y., Utzschneider, D. A., Sakatani, K., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+attenuation+of+GABA+sensitivity+in+the+maturing+myelin-deficient+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The attenuation of GABA sensitivity in the maturing myelin-deficient rat optic nerve.</a> Brain Res Dev Brain Res. 72 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Singh, D., Dromel, P. C., Perepelkina, T., Baranov, P., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C6+cell+injection+into+the+optic+nerve+of+long-evans+rats%3A+A+short-term+model+of+optic+pathway+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">C6 cell injection into the optic nerve of long-evans rats: A short-term model of optic pathway gliomas.</a> Cell Transplant. 29, 963689720964383(2020).</li>
<li>Schwaner, S. A., Feola, A. J., Ethier, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+optic+nerve+head+biomechanics+in+a+rat+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Factors affecting optic nerve head biomechanics in a rat model of glaucoma.</a> J R Soc Interface. 17 (165), 20190695(2020).</li>
<li>Ellouze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+allotopic+expression+of+the+human+mitochondrial+ND4+prevents+blindness+in+a+rat+model+of+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Optimized allotopic expression of the human mitochondrial ND4 prevents blindness in a rat model of mitochondrial dysfunction.</a> Am J Hum Genet. 83 (3), 373-387 (2008).</li>
<li>Kwon, H., Park, M., Nepali, S., Lew, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-preconditioned+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+rescue+optic+nerve+axons+via+differential+roles+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+an+optic+nerve+compression+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-preconditioned placenta-derived mesenchymal stem cells rescue optic nerve axons via differential roles of vascular endothelial growth factor in an optic nerve compression animal model.</a> Mol Neurobiol. 57 (8), 3362-3375 (2020).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> J Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Raykova, K., Jones, M. V., Huang, H., Hoffman, P. F., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally-invasive+Technique+for+Injection+into+Rat+Optic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve.</a> J Vis Exp. (99), e52249(2015).</li>
<li>Hallas, B. H., Wells, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+mulitple+injections+into+the+mamallian+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A novel technique for mulitple injections into the mamallian optic nerve.</a> Kopf Carrier. 54, 1-10 (2000).</li>
<li>Yan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+optic+nerve+transection+in+rats%3A+A+model+established+with+a+new+operative+approach+to+assess+secondary+degeneration+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Partial optic nerve transection in rats: A model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (128), e56272(2017).</li>
<li>Han, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+progenitor+cell+grafts+in+immunocompromised+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of human induced pluripotent stem cell-derived retinal progenitor cell grafts in immunocompromised rats.</a> Cell Transplantation. 31, 1-25 (2022).</li>
<li>Tang, Y., Gutmann, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+Type+1-associated+optic+pathway+gliomas%3A+Current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Manag+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis Type 1-associated optic pathway gliomas: Current challenges and future prospects.</a> Cancer Manag Res. 15, 667-681 (2023).</li>
<li>Pan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+biomimetic+polydopamine+nanocomposite+scaffold+promotes+optic+nerve+regeneration+through+modulating+inhibitory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Implantation of biomimetic polydopamine nanocomposite scaffold promotes optic nerve regeneration through modulating inhibitory microenvironment.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 683(2024).</li>
<li>Gokoffski, K. K., Peng, M., Alas, B., Lam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-protection+and+neuro-regeneration+of+the+optic+nerve%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-protection and neuro-regeneration of the optic nerve: recent advances and future directions.</a> Curr Opin Neurol. 33 (1), 93-105 (2020).</li>
<li>Negishi, H., Dezawa, M., Oshitari, T., Adachi-Usami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+within+artificial+Schwann+cell+graft+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat.</a> Brain Res Bull. 55 (3), 409-419 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542</td><td>Diluizione 1:10.000, utilizzato per la colorazione di criosezioni</td></tr><tr><td>Particelle virali AAV</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td>Vettore utilizzato per l'iniezione del nervo ottico</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Aqua-Mount</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td>Utilizzato per il montaggio di criosezioni colorate</td></tr><tr><td>Siero bovino albumina&nbsp;</td><td>Prodotti di ricerca International Corp</td><td>9048-46-8</td><td>Utilizzato nel processo per la colorazione di criosezioni</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>Diluizione 1:1000, utilizzato per la colorazione di criosezioni</td></tr><tr><td>Gas isoflorane</td><td>Primal Healthcare</td><td>66794-017-10</td><td>Gas per anestesia</td></tr><tr><td>Sistema di microscopio confocale verticale Leica TCS SPE&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A Microscopio</td><td>confocale</td></tr><tr><td>Siringa Luer lock</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Siringa per iniezione</td></tr><tr><td>Microm HM505E criostato&nbsp;</td><td>Microm</td><td>M-HM360 da Marshall Scientific</td><td>Utilizzato per il sezionamento di campioni</td></tr><tr><td>di ratto anti-GFP&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>338002</td><td>diluizione 1:500, utilizzato per la colorazione di criosezioni</td></tr><tr><td>Gancio per midollo spinale</td><td>F.S.T</td><td>10162-12</td><td>Gancio utilizzato per isolare il nervo ottico</td></tr><tr><td>Siringa da dieci microlitri</td><td>Hamilton</td><td>CAL 803901</td><td>Siringa per iniezione</td></tr><tr><td>Ago da trentatré calibri</td><td>JBP</td><td>JBP3308B</td><td>Ago per iniezione</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek OCT&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td>Utilizzato per la lavorazione del criomold</td></tr><tr><td>Pinze dentate</td><td>Bausch e Lomb</td><td>E1809</td><td>Pinze per afferrare la congiuntiva</td></tr><tr><td>Forbici curve per tenotomia Westcott</td><td>Forbici Bausch e Lomb</td><td>E3323-R</td><td>per creare peritomia</td></tr></tbody></table>

approccio transcongiuntivale per l'iniezione nel nervo ottico del ratto

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

I risultati sperimentali rappresentativi che utilizzano questa tecnica per l'iniezione del nervo ottico di ratto sono mostrati nella Figura 2. In questo esempio, il virus adeno-associato-eGFP (AAV-eGFP) è stato iniettato nel nervo ottico di ratto utilizzando la tecnica transcongiuntivale descritta sopra con un ago da 33 G collegato a una siringa da 10 μL. Questi risultati facevano parte di un esperimento che utilizzava questa tecnica per studiare l'iniezione del nervo ottico come parte di un obiettivo finale per utilizzare l'AAV per fornire la correzione CRISPR ai nervi ottici in un modello di ratto di neurofibromatosi 1 (NF1). Per sviluppare la tecnica di iniezione è stata utilizzata una combinazione di colorante e vettore AAV. Gli animali venivano sacrificati sette giorni dopo l'iniezione nel nervo ottico. I nervi sono stati quindi sezionati e marcati con anticorpi anti-GFP per consentire l'imaging del nervo ottico con microscopia confocale per confermare che il materiale era penetrato con successo nella guaina del nervo ottico ed era entrato nel nervo ottico. Il successo dell'introduzione del materiale nel nervo ottico è stato confermato dalla colorazione degli anticorpi ed è apparso verde alla microscopia confocale, come mostrato nella Figura 2A. Nei casi in cui la penetrazione attraverso la guaina del nervo ottico non era completa, o c'era efflusso di materiale dalla traccia dell'ago, la colorazione è stata osservata lungo il bordo della guaina del nervo ottico piuttosto che all'interno del tessuto nervoso, come mostrato nella Figura 2C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig01.jpg"> 
Figura 1: Sequenza delle fasi chirurgiche. (A) La congiuntiva viene afferrata con una pinza dentata e le forbici Westcott vengono utilizzate per creare una peritomia limbare. (B) Dopo che la fascia del tenone è stata aperta e sezionata senza mezzi termini, l'orbita viene esposta con l'assistenza delle forbici di Westcott. (C) Un gancio del midollo spinale viene inserito e utilizzato per isolare il nervo ottico. (D) Dopo la dissezione smussata del tessuto orbitale sovrastante, il nervo ottico viene esposto utilizzando il gancio del midollo spinale. (E) Un ago da 33 G viene utilizzato per perforare la guaina del nervo ottico e iniettare adenovirus o colorante nel nervo ottico. (F) Il globo viene riposizionato nell'orbita e la congiuntiva viene riposizionata sopra il sito della peritomia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig02.jpg"> 
Figura 2: Immagine panoramica confocale fluorescente rappresentativa del nervo ottico di ratto 7 giorni dopo l'iniezione riuscita di AAV-eGFP (verde) in cui il vettore ha trasdotto i neuroni vicino al chiasma ottico. (A) I nuclei del nervo ottico sono marcati con DAPI (blu). ONH con freccia denota la testa del nervo ottico o l'estremità orbitale del nervo, mentre l'estremità del chiasma ottico è etichettata come "chiasma". (B) Fotografia di un nervo ottico di ratto dall'orbita al chiasma incorporato in un blocco di criosezione congelato. Il nervo viene iniettato con inchiostro di china immediatamente posteriormente all'orbita (sito di iniezione indicato da una freccia nera) per orientare il nervo ottico. (C) Immagine fluorescente panoramica del nervo ottico di ratto 7 giorni dopo l'iniezione non riuscita di AAV-eGFP (verde) in cui la maggior parte della sospensione vettoriale probabilmente è fluita fuori dal tratto nervoso, trasducendo la guaina ottica. I nuclei del nervo ottico sono marcati con DAPI (blu). ONH denota la testa del nervo ottico immediatamente posteriore alla retina neurale e il sito di iniezione indicato da una freccia bianca. Il chiasma e la freccia bianca demarcano verso il chiasma ottico. Barre di scala = 400 μm in (A) e 200 μm in (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Variabile</td>
			<td colspan="3">Avvicinarsi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>transcongiuntivale</td>
			<td>Superiore</td>
			<td>Laterale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incisione cutanea</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incisione congiuntivale</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopio</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troncazione del muscolo orbitario superiore</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutura di trazione</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gancio del midollo spinale</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutura cutanea</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Confronto con tecniche precedentemente pubblicate per isolare il nervo ottico di ratto per lo studio sperimentale. Le variabili, tra cui la necessità di incisione cutanea, incisione congiuntivale, microscopio operatorio, sezione del muscolo orbitale superiore, sutura di trazione, gancio del midollo spinale e sutura cutanea, vengono confrontate utilizzando gli approcci transcongiuntivale, superiore e laterale.

Approccio transcongiuntivale per l'iniezione nel nervo ottico del ratto

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

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Iniezione intravitreale per stabilire Modello malattie oculari

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Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

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Una tecnica di iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre il glaucoma nei ratti

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Tecnica mini-invasiva per iniezione in Rat nervo ottico

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Il modello di roditore di nonarteritic Neuropatia ottica ischemica anteriore (rNAION)

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Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

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Iniezione intracamerale nei ratti con basso rischio di effetti avversi

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