Sviluppo di un modello di lesione polmonare acuta di suinetto neonatale che ricrea l'ambiente precoce dei polmoni del neonato pretermine

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello neonatale di suinetto di danno polmonare acuto che modella gli eventi patogeni precoci che si verificano nel polmone pretermine, tra cui quantità di tensioattivo inadeguata, iperossia, ventilazione ad alta pressione e infiammazione, per facilitare la comprensione dei fattori molecolari scatenanti della displasia broncopolmonare e migliorare la traduzione terapeutica.

Il laboratorio del Dr.Thebaud è all'avanguardia nell'uso di cellule stromali mesenchimali derivate dal tessuto del cordone ombelicale per la malattia polmonare neonatale, chiamata anche displasia broncopolmonare. Il successo della traduzione clinica è il fulcro dei nostri sforzi attuali. Abbiamo recentemente completato uno studio clinico di fase uno sulla somministrazione endovenosa di cellule stromali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale a neonati prematuri a rischio di sviluppare displasia broncopolmonare, fornendo importanti dati di sicurezza per futuri studi di efficacia.

Tuttavia, rimangono domande importanti. Questo modello animale di grandi dimensioni consentirà l'ottimizzazione della somministrazione e della capacità terapeutica delle cellule stromali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale e faciliterà la traduzione clinica di nuove terapie per i pazienti. Il nostro modello di danno polmonare acuto neonatale nei suinetti appena nati imita le esposizioni precoci dei polmoni umani prematuri con deplezione di tensioattivo, iperossia, ventilazione ad alta pressione e infiammazione, tutti fattori coinvolti nella fisiopatologia della displasia broncopolmonare.

Questo modello offre informazioni sui primi processi patogeni della BPD. Gli studi di prova di sicurezza ed efficacia nel nostro modello di suinetto forniranno progressi sui candidati terapeutici per il danno polmonare acuto nei neonati prematuri. Per iniziare, accendere l'apparecchio di aspirazione e verificare che sia pronto per l'uso.

Installare il secchio di raccolta del lavaggio in posizione. Pesare gli assorbenti prima di iniziare il lavaggio, quindi posizionare gli elettrodi sotto la testa dell'animale e sotto il tavolo chirurgico per raccogliere tutto il liquido fuoriuscito durante il lavaggio. Impostare il ventilatore su una pressione positiva di fine espirazione di cinque centimetri di acqua, una pressione inspiratoria di picco di 25 centimetri di acqua, una frequenza respiratoria di 25 al minuto e una frazione di ossigeno inspirato di uno.

Scollegare ora il circuito ventilatorio dal tubo endotracheale e collegare l'apparecchio a imbuto di lavaggio. Per instillare soluzione salina nei polmoni, versare delicatamente 30 millilitri per chilogrammo di soluzione salina isotonica calda nell'imbuto tenuto a circa 30 centimetri sopra il suinetto anestetizzato. Premere bilateralmente sulla parte laterale dell'area della gabbia toracica per fornire una compressione meccanica e massaggiare l'area.

Quindi abbassare l'imbuto sotto il suinetto per iniziare il drenaggio del fluido e scollegare leggermente l'imbuto dal tubo endotracheale per consentire al fluido di lavaggio di fluire nel secchio di raccolta sul pavimento. Quindi, inserire il catetere di aspirazione nel tubo endotracheale ed eseguire l'aspirazione attiva per non più di 10 secondi continuando il massaggio della gabbia toracica per favorire la rimozione dei liquidi. Ora ricollega il circuito ventilatorio al tubo endotracheale e lascia che il suinetto si riprenda per almeno tre minuti tra un giro di lavaggio e l'altro per ridurre lo stress e il rischio di intolleranza.

Iniziare il successivo ciclo di lavaggio una volta che la saturazione periferica di ossigeno torna al 100%Durante il lavaggio, i livelli di saturazione di ossigeno possono scendere fino a cinque. Se la saturazione non torna al 100%, attendere la stabilizzazione e controllare la pressione parziale dell'ossigeno tramite l'emogasanalisi. Confermare che la lesione da esaurimento del tensioattivo si ottiene quando la pressione parziale dell'ossigeno rimane al di sotto di 100 millimetri di mercurio per 15 minuti.

Preparare il lipopolisaccaride o LPS da Escherichia coli alla dose di 1,5 milligrammi per chilogrammo in soluzione fisiologica normale e aspirare un totale di due millilitri in una siringa da tre millilitri. 15 minuti dopo l'ultimo lavaggio polmonare, prepararsi per l'instillazione di LPS mentre il suinetto è in posizione supina. Per migliorare la distribuzione omogenea di LPS nel polmone atelettico, sostituire l'estremità standard del tubo endotracheale con un adattatore a porta larga per consentire la ventilazione simultanea e la somministrazione di LPS.

Applicare una pressione positiva di fine espirazione di 10 centimetri di acqua per un minuto. Regolare il picco della pressione inspiratoria per mantenere il volume corrente a sette millilitri per chilogrammo e impostare la frequenza respiratoria a 40 respiri al minuto. Quindi inserire un catetere attraverso la porta laterale dell'adattatore a Y nel tubo endotracheale a una profondità premisurata in modo che la punta si estenda da uno a due millimetri oltre il tubo.

A questo punto, iniettare l'LPS attraverso il catetere e lavare il catetere con un millilitro di soluzione fisiologica normale, seguito da un bolo d'aria di nove millilitri per garantire l'erogazione completa. Quindi rimuovere il catetere e chiudere la porta laterale. Continuare con una pressione positiva di fine espirazione di 10 centimetri di acqua, regolando la pressione inspiratoria di picco per mantenere il volume corrente a sette millilitri per chilogrammo per tre minuti dopo la somministrazione di LPS per ottimizzare la distribuzione nei polmoni.

Scollegare il circuito del ventilatore dal tubo endotracheale per 30 secondi per interrompere qualsiasi possibile reclutamento polmonare ottenuto. Durante il periodo di disconnessione, regolare le impostazioni del ventilatore. Una volta che il volume corrente si è stabilizzato a sette millilitri per chilogrammo, registrare le misurazioni fisiologiche del punto temporale dell'ora zero e completare il foglio del modulo di segnalazione del caso.

Regolare la frequenza respiratoria in base alla pressione parziale dell'anidride carbonica dall'analisi dei gas nel sangue. Continuare la ventilazione a volume controllato come descritto in precedenza per il periodo di osservazione di sei ore. Utilizzare le misurazioni orarie dei gas ematici per guidare le regolazioni della frequenza respiratoria per il resto dell'esperimento e regolare continuamente la pressione inspiratoria di picco per mantenere il volume corrente a sette millilitri per chilogrammo.

Gli animali con più colpi hanno mostrato un indice di ossigenazione significativamente aumentato tra 8 e 12 nel periodo di sei ore, indicando un danno polmonare da moderato a grave, mentre la loro pressione parziale di ossigeno rispetto alla frazione del rapporto ossigeno inspirato è diminuita notevolmente. La compliance del sistema respiratorio è stata ridotta di oltre il 50% rispetto agli animali di controllo. I polmoni multi-hit hanno mostrato chiari segni macroscopici di danno polmonare a chiazze concentrate nella regione centrale posteriore rispetto ai controlli.

L'analisi istologica ha rivelato una marcata infiltrazione neutrofila e un ispessimento dei setti alveolari negli animali multi-hit, indicando un grave danno strutturale, inclusa la deposizione di detriti proteici negli spazi alveolari. I neutrofili costituivano oltre il 75% della popolazione di cellule del liquido di lavaggio broncoalveolare negli animali con più colpi sei ore dopo la lesione. I livelli di interleuchina-6 erano altamente elevati nel liquido di lavaggio broncoalveolare e nel tessuto polmonare degli animali multi-hit rispetto ai controlli, riflettendo un'intensa risposta infiammatoria.