In vivo L'imaging rivela il comportamento migratorio dei leucociti all'interno delle articolazioni

Poiché le cellule ossee del sangue dei leucociti derivano dal midollo osseo, devono quindi entrare nei tessuti per causare infiammazione. Il controllo di questo processo rappresenta un punto chiave in cui si potrebbero sviluppare nuove terapie per attenuare l'infiammazione. In generale, il traffico leucocitario nel tessuto infiammato avviene nelle venule post-capillari e segue la cascata di adesioni, che inizia con la cattura dei leucociti a flusso libero dalla parete del vaso.

Segue il rotolamento lungo la parete del recipiente nella direzione pro. Arresto per endotelio. Quindi c'è dall'adesione e dall'avanzamento in tutte le direzioni sulla superficie del vaso per localizzare una posizione rispettiva e la migrazione transendoteliale in una posizione specifica all'interno del tessuto.

Innescano infiammazioni. Questi passaggi distinti sono regolati dalla combinazione di segnali molecolari inclusi i chemoattragenti. Il chemoattrante attiva i leucociti tramite ZP Cs e svolge ruoli fondamentali nella cascata migratoria.

Quindi, ulteriori studi finali e esperimenti in vitro non hanno fornito informazioni su come il chemoattractant e il recettore chemoattractant rivelano dinamicamente il comportamento migratorio dei leucociti in vivo. I recenti progressi nella tecnologia di imaging hanno fornito visioni senza precedenti sulla migrazione delle cellule immunitarie negli animali vivi, migliorando notevolmente la nostra comprensione della regolazione molecolare del traffico cellulare immunitario in vivo. Recentemente, abbiamo fatto domanda per indagare il meccanismo molecolare che controlla il traffico dei neutrofili verso i siti di infiammazioni articolari.

Quindi la nostra imaging articolare in vivo, costruiscono questo nuovo paradigma nelle reazioni di ipersensibilità di tipo III all'interno dell'articolazione. Quindi, il nostro componente del complemento C5a agisce come un promotore dell'infiammazione, mentre le cellule residenti nei tessuti giocano ruoli più significativi nell'infiammazione nell'attuale paradigma delle reazioni di ipersensibilità di tipo III. Pertanto, l'imaging in vivo dell'articolazione è una tecnica preziosa per scoprire il comportamento migrato dei leucociti e la dinamica molecolare con l'articolazione infiammata.

Quindi condividiamo questo protocollo per l'imaging articolare in vivo a supporto dei gruppi di ricerca che studiano questo processo nelle articolazioni infiammate. Prepara il collagene bovino di diluizione tipo II in acido acetico molare 0,05 scuotendo per tutta la notte a quattro gradi per creare l'emulsione, miscela la diluizione del collagene con l'adiuvante Freund completo in un rapporto 1:2 in una siringa di vetro. Poteva anche essere mescolato a mano per circa 20 minuti.

Questo processo genera calore, quindi raffredda la siringa di vetro contenente emulsione su ghiaccio. Un topo anestetizzato prima delle vaccinazioni. Modella i peli lungo la coda con un tagliacapelli per prepararti all'immunizzazione.

Iniettare lentamente un volume di 100 microlitri dell'emulsione nello spazio sottocutaneo vicino alla base della coda. La valutazione clinica dell'artrite e la misurazione dello spessore delle zampe sono essenziali per valutare l'attività della malattia. Tipicamente, il punteggio clinico per l'artrite e le misurazioni dello spessore delle zampe vengono effettuati ogni uno o tre giorni dopo le prime vaccinazioni.

Il punteggio clinico per l'artrite a questo punteggio è la somma dei punteggi per tutte e quattro le zampe di ciascun topo. I punteggi sono registrati come segue. Quindi, zero è anomalo.

Uno è l'eritema e il gonfiore di un dito. Due è l'eritema e il gonfiore di due dita o eritema e gonfiore dell'articolazione della caviglia. Il terzo è eritema e gonfiore di più di tre dita o gonfiore di due dita e dell'articolazione della caviglia.

Quattro è eritema e grave gonfiore della caviglia, del piede e del dito con deformità. Quindi, la misurazione dello spessore delle zampe è misurata dello spessore di ciascuna zampa usando pinze digitali a scorrimento. Per ogni topo viene utilizzata la misurazione media dello spessore delle zampe su tutte e quattro le zampe.

I topi vengono anestetizzati e poi modellano la gamba del topo con una tosa. Usa una crema depilatoria per rimuovere eventuali peli residui. Rimuovi la crema con una garza umida.

Applicare un lubrificante corneale sterile su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale e ridurre il rischio di oscillazione corneale. Con un miriacoloscopo chirurgico, eseguire un'incisione di un centimetro lungo la pelle usando microforbici. Copri l'imaging in precedenza con l'1,5% di agarosio e PBS.

Il palcoscenico è allestito al microscopio. Regola le impostazioni del microscopio confocale inclusi la potenza, il guadagno, lo offset e la posizione. Una volta identificata la posizione adatta, si inizia l'acquisizione dell'immagine.

Un risultato rappresentativo della CIA. Tipicamente, l'insorgenza dell'artrite si osserva intorno al giorno 28, con punteggio clinico per l'artrite e lo spessore delle zampe che raggiunge il picco nel giorno 35. L'incidenza di CIA sui topi DBA 1-day è solitamente superiore al 900-100% entro il 35° giorno.

Qui, il film a sinistra mostra il joint in mouse di controllo e quello a destra mostra il joint in topi CIA. In questi film, le cellule verdi rappresentano neutrofili positivi a Ly6G. I globuli arancioni indicano cellule T CD4 positive, mentre le aree bianche corrispondono ai vasi sanguigni.

Al giorno 35, si può vedere chiaramente che più neutrofili positivi a Ly6G sono presenti al di fuori dei vasi sanguigni rispetto alle cellule T CD4+. Questi neutrofili sono altamente mobili, muovendosi attivamente in più direzioni all'interno dell'articolazione infiammata. Qui sto mostrando l'analisi rappresentativa dell'imaging in-vivo delle articolazioni.

Il grafico a sinistra mostra il numero di neutrofili appena attaccati, mentre quello a destra mostra il numero di neutrofili appena trasmigrati durante una registrazione di 30 minuti. Nelle articolazioni artritiche, il numero sia di neutrofili appena attaccati che di quelli trasmigrati è significativamente superiore rispetto a quelli osservati nelle articolazioni di controllo. In conclusione, presentiamo il nostro attuale protocollo per l'imaging in-vivo delle articolazioni, che consente la visualizzazione ad alta risoluzione e in tempo reale del comportamento migratorio dei leucociti nei topi viventi in condizioni fisiologiche e patologiche.

Questa tecnica ci permette di osservare direttamente come le cellule immunitarie interagiscono all'interno dei tessuti infiammati, come aderiscono alle pareti dei vasi sanguigni, trasmigrano nel tessuto e orchestrino la risposta infiammatoria. Attraverso questo approccio, possiamo catturare comportamenti cellulari dinamici che altrimenti sarebbero invisibili con metodi istologici o in vitro convenzionali. Combinando questo sistema di imaging con analisi quantitative e marcatori molecolari, siamo in grado di scoprire vie chiave che guidano l'inizio e la progressione dell'artrite.

È importante sottolineare che le intuizioni ottenute da queste osservazioni in vivo non solo approfondiscono la nostra comprensione della dinamica delle cellule immunitarie, ma forniscono anche una base scientifica per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Man mano che questa tecnologia continua a evolversi, e con l'adattamento e perfezionamento della metodologia sempre più ricercatori, crediamo che l'imaging in vivo diventerà una piattaforma essenziale per studiare malattie immunitarie complesse e rappresenta una potente breccia che collega l'immunologia di base alla ricerca traslazionale e clinica. In definitiva, speriamo che questo approccio contribuisca a sviluppare terapie innovative per l'artrite reumatoide e altre malattie infiammatorie croniche nel prossimo futuro.