Imaging multiplex a immunofluorescenza basato su codice a barre del DNA per analizzare campioni FFPE da melanoma murino geneticamente riprogrammato

Presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la validazione di un pannello di immunofluorescenza multiplex per studiare i tessuti FFPE di topo e dimostriamo la sua utilità studiando campioni da un modello di melanoma trattato con nanoparticelle che rilasciano DNA plasmatico, codificando segnali immunologici per la riprogrammazione del microambiente tumorale. Nel campo mancavano protocolli di immunofluorescenza multiplex rigorosamente sviluppati e convalidati compatibili con i tessuti FFPE di topo fissati in formalina e inclusi in paraffina.

L'inclusione di paraffina fissata in formalina preserva la morfologia dei tessuti a lungo termine, è facile da maneggiare e conservare e consente la creazione di microarray di tessuti per la visualizzazione di più campioni su un singolo vetrino.

L'imaging proteomico spaziale migliorerà la visualizzazione e l'analisi di un complesso microambiente tumorale, aiutando in ultima analisi nella previsione delle risposte immunitarie, che possono contribuire allo sviluppo di terapie migliori.

Utilizzeremo questo protocollo per consentire una migliore profilazione spaziale dei modelli tumorali murini in molti altri tipi di tumore e diversi organi immunitari.

[Narratore] Per iniziare, cuocere i vetrini di tessuto FFPE a 60 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo raffreddare i vetrini a temperatura ambiente per 10 minuti prima di iniziare la deparaffinazione e la reidratazione. Successivamente, incubare i vetrini in soluzione di xilene due volte per cinque minuti ciascuno per rimuovere la paraffina, quindi reidratare il tessuto spostando i vetrini attraverso etanolo al 100% due volte per cinque minuti ciascuno. Posizionare il vetrino in sequenza in soluzioni di etanolo al 90%, 70%, 50% e 30% per cinque minuti ciascuna. Lavare i vetrini due volte con acqua distillata per cinque minuti ciascuno. Eseguire il recupero dell'antigene, quindi utilizzare una soluzione sbiancante fresca per sbiancare il tessuto due volte a intervalli di 45 minuti prima di eseguire la colorazione degli anticorpi. Successivamente, eseguire la colorazione degli anticorpi durante la notte a quattro gradi Celsius utilizzando una camera di plastica. Dopo la colorazione, rimuovere la camera di plastica e raccogliere il cocktail di anticorpi precedentemente applicato. Lavare i vetrini due volte in tampone colorante per due minuti ciascuno. Incubare i vetrini in un barattolo colorante contenente 40 millilitri di soluzione fissante post-colorazione per 10 minuti, quindi sciacquarli con PBS tre volte per due minuti ciascuno. Ora trasferisci i vetrini in metanolo ghiacciato per cinque minuti, prima di risciacquare con PBS. Applicare 200 microlitri di soluzione fissativa finale su ogni vetrino sotto una camera di umidità. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, lavare nuovamente i vetrini in PBS per tre cicli di due minuti ciascuno. In caso di imaging immediato, strofinare il vetrino attorno al tessuto utilizzando un panno privo di lanugine. Premere la cella di flusso per 30 secondi utilizzando l'attrezzatura di assemblaggio della cella di flusso. Se l'imaging è successivo, conservare il vetrino senza applicare la cella di flusso nel buffer di conservazione a quattro gradi Celsius. Quando sono pronti per l'imaging, trasferire i vetrini dal buffer di archiviazione al PBS per 10 minuti prima di applicare la cella di flusso. Quindi, preparare i buffer DMSO in fase di rodaggio in base ai cicli di imaging desiderati. Preparare la soluzione stock reporter necessaria per il numero totale di cicli di imaging. Pipettare 250 microlitri di soluzione stock reporter e cinque microlitri di ciascun reporter in provette per microcentrifuga da un millilitro nere o ambrate etichettate. Trasferire la soluzione in una piastra nera a 96 pozzetti e sigillarla con un foglio adesivo. Ora avvia il dispositivo di imaging e utilizza il gestore degli strumenti per impostare i parametri e i tempi di esposizione. Posizionare la piastra reporter nel dispositivo, quindi posizionare il vetrino nel supporto del microscopio per iniziare l'imaging. Acquisire immagini di tessuti macchiati. Installa l'ultima versione del software di analisi patologica digitale. Fare clic su Crea progetto e selezionare una cartella di destinazione per lo spazio del progetto. Quindi, fai clic su Aggiungi immagini, seguito da Scegli file. Quindi vai al file QuP TIFF prodotto dall'imaging a immunofluorescenza multiplex. Imposta il tipo di immagine su fluorescenza, mantieni le impostazioni predefinite e fai clic su Importa. Se si utilizza QuPath, fare doppio clic sulla nuova immagine per aprire un'area di lavoro, quindi premere periodicamente File e Salva per tenere traccia delle modifiche al progetto. Attiva/disattiva le impostazioni di visibilità e visualizzazione dei marcatori utilizzando lo strumento luminosità e contrasto nella barra degli strumenti. Usa lo strumento pennello o bacchetta per disegnare un'annotazione attorno all'intera sezione di tessuto. Definire questa annotazione come tessuto completo, escludendo la pelle sovrastante o le regioni che non devono essere analizzate. Tenere premuto il tasto ALT per creare annotazioni negative o ridurre i contorni. Ora scegli l'annotazione facendo clic sulla scheda Annotazioni e premendo Oggetti seguito da Annotazioni, quindi fai clic su Duplica annotazioni selezionate. Attiva il canale SOX 10, quindi riduci l'annotazione duplicata per definire la regione tumorale utilizzando ALT + strumento pennello/bacchetta. Ora seleziona l'annotazione completa del tessuto. Quindi vai su Oggetti seguito da Annotazioni ed Espandi annotazioni. Impostare il raggio di espansione su un micrometro e fare clic su Esegui. Rinominare questa nuova annotazione come Espansione completa dei tessuti. Selezionare l'annotazione del tumore, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Inserisci nella gerarchia. Riseleziona l'annotazione del tumore, quindi vai su Oggetti, Annotazioni e ora fai clic su Rendi inverso. Definire questa nuova annotazione come Stroma e ripetere l'operazione per tutte le sezioni di tessuto. Per eseguire la segmentazione delle celle, fare clic sulla scheda Immagine per trovare la larghezza in pixel e l'altezza dell'immagine. Scarica l'estensione StarDist da GitHub. Importa il file StarDist.jar dell'estensione QuPath in QuPath. Scaricare anche i file di script groovy di StarDist e il file del modello da GitHub. Per ogni sezione di tessuto, selezionare sia le annotazioni del tumore che quelle dello stroma. Nella barra delle impostazioni, fai clic su Automatizza seguito da Script Editor per aprire l'interfaccia dello script. Aprire lo script di segmentazione delle celle StarDist appropriato corrispondente alla dimensione in pixel dell'immagine. Quando richiesto, selezionare StarDistcellsegmodel.pb per la segmentazione delle celle. Dopo la segmentazione delle celle, salvare l'immagine, fare clic in sequenza su Misura, Esporta misurazioni, selezionare le immagini corrispondenti e impostare il tipo di esportazione come celle e il separatore come .csv. Scegli una posizione per il file di output, quindi fai clic su Compila per includere le metriche pertinenti. Per ogni marcatore di derivazione da utilizzare nel clustering o nella fenotipizzazione, selezionare un valore medio da esportare. Per la normalizzazione dei dati proteomici, aprire il file CSV esportato e troncare le intestazioni delle colonne per mantenere solo il nome del marcatore. Dopo aver installato la versione più recente di R & R Studio, scaricare lo script .r di normalizzazione dei marcatori da GitHub ed eseguirlo per filtrare le celle in base alle dimensioni nucleari. Eseguire la normalizzazione minima/massima per ogni marcatore. Una volta completato, salva il nuovo file CSV con i dati normalizzati. La coniugazione del codice a barre del DNA dell'anticorpo è stata confermata mediante elettroforesi su gel proteico, mostrando bande aggiuntive nella regione della catena pesante. L'imaging multiplex in immunofluorescenza dei tumori del fianco B16-F10 trattati con nanoparticelle 4-1BBL/IL-12 e anti-PD1 sistemico ha mostrato un'espressione distinta di marcatori immunitari nelle sezioni tumorali. Il clustering FlowSOM ha identificato una gamma più ampia di intensità di espressione dei marcatori rispetto alla fenotipizzazione di Seurat, con una differenza di intensità massima di circa 0,7 rispetto a 0,5. La fenotipizzazione FlowSOM ha anche classificato un numero maggiore di macrofagi nei sottotipi M1 e M2. La quantificazione delle densità dei macrofagi ha mostrato che FlowSOM ha rilevato densità più elevate di macrofagi M1 e M2 rispetto a Seurat, mentre Seurat ha classificato più macrofagi come Altro. L'analisi spaziale ha rivelato che i macrofagi M2 e le cellule natural killer avevano le distanze minime medie più alte dopo il trattamento e i macrofagi M1 erano più diffusi intorno alle cellule T CD8.