Definizione di modelli in vitro di coltura dei gangli della radice dorsale: approcci complementari per lo studio del crosstalk cancro-nervo

La nostra ricerca si concentra sul crosstalk cancro-nervo, utilizzando gangli della radice dorsale 3D o espianti di DRG e colture dissociate 2D per quantificare la migrazione tumorale neuro-guidata e per testare strategie molecolari per limitare la loro interazione. Con questo protocollo, abbiamo stabilito colture DRG 3D e 2D complementari, ottimizzato la crescita dei neuriti e dimostrato un aumento dell'invasione delle cellule tumorali lungo le estensioni dei neuriti. Abbiamo affrontato la mancanza di modelli riproducibili che catturino sia le complesse interazioni a livello cellulare che l'architettura nervosa intatta creando colture DRG 2D e 3D complementari da un singolo topo.

Il nostro protocollo produce espianti 3D accoppiati e colture di neuroni 2D da un singolo topo, preservando la struttura angolare, consentendo l'imaging ad alto contenuto, riducendo l'uso da parte degli animali e consentendoci di ottenere dati a livello di tessuto e di singole cellule in un unico esperimento. Il nostro modello ha aperto domande su quali fattori creati da DRG guidano l'invasione, come l'attività dei neuroni, l'età e il genotipo la modellano e se il targeting dei recettori dei fattori neurotrofici potrebbe ridurre la diffusione del cancro guidata dai neuriti. Per iniziare, stendi un topo soppresso sul suo addome.

Radere il pelo, concentrandosi sull'area sopra la colonna vertebrale per esporre la superficie dorsale. Spruzzare il 70% di etanolo sulla schiena dell'animale. Usando salviette di carta, strofinare dalla coda al cranio per rimuovere il pelo sciolto e prevenire la contaminazione durante la dissezione.

Con un paio di forbici sterilizzate, praticare un'incisione diritta lungo la linea mediana dorsale dalla coda al cranio. Usando una pinza smussata, ritrarre la pelle su entrambi i lati dell'incisione per esporre la colonna vertebrale. Ora, usa un paio di forbici e pinze nuove per evitare la contaminazione e fai un'incisione orizzontale all'estremità della coda della colonna vertebrale.

Quindi praticare due incisioni longitudinali parallele su entrambi i lati della colonna vertebrale per rilasciarla. Usa una pinza per sollevare delicatamente la colonna vertebrale e rimuovere il tessuto connettivo circostante. Per rilasciare completamente la colonna vertebrale, praticare un'incisione nella parte superiore della colonna vertebrale vicino al cranio.

Trasferire la colonna vertebrale in una piastra pre-raffreddata di 10 centimetri contenente HBSS con penicillina streptomicina tenuta in ghiaccio. Quindi, usa le forbici a molla per rimuovere il tessuto connettivo rimanente dalla colonna vertebrale ed esporre le vertebre. Trasferire la colonna vertebrale tagliata su un tavolino da microscopio.

Dividi con cura la colonna lungo il piano sagittale usando le forbici a molla. Usando una pinza a punta fine, rimuovere il midollo spinale dalla colonna per rivelare i gangli della radice dorsale lungo le radici dei nervi spinali. Taglia i nervi spinali usando le forbici a molla.

Quindi rimuovere il tessuto connettivo circostante dai gangli della radice dorsale. Usando una pinza a punta fine, estrarre delicatamente i gangli della radice dorsale dalle radici dorsali. Per la coltura a montatura intera, posizionare i DRG in una piastra di tre centimetri contenente HBSS con penicillina streptomicina mantenuta in ghiaccio.

Utilizzare puntali per pipette pre-raffreddati per erogare due microlitri di Matrigel refrigerato in ciascun pozzetto di un vetrino con fondo in vetro a otto pozzetti posizionato all'interno di una piastra di 10 centimetri su ghiaccio. Per evitare una polimerizzazione prematura, pipettare solo una goccia alla volta. Quindi, usa una pinza a punta fine per posizionare un ganglio della radice dorsale su una piastra asciutta.

Agitare delicatamente per rimuovere l'eccesso di HBSS. Quindi trasferire il ganglio della radice dorsale pulito nella gocciolina di Matrigel. Dopo aver trasferito tutti i gangli nelle goccioline, incubare il vetrino con fondo di vetro in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per cinque minuti per consentire al Matrigel di polimerizzare.

Quindi, aggiungere con cura 200 microlitri di terreno di coltura caldo e integrato a ciascun pozzetto. Incubare il vetrino a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Utilizzare la microscopia a campo chiaro per monitorare quotidianamente i gangli della radice dorsale per la crescita e la vitalità neuronale.

Centrifugare una provetta conica da 15 millilitri contenente gangli radicolari dorsali raggruppati a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver pipettato l'HBSS, sciacquare i gangli con un terreno integrato preriscaldato e picchiettare delicatamente. Quindi centrifugare la provetta per cinque minuti a 200 G per pellettare i DRG.

Sostituire il terreno con un millilitro di soluzione di papaina. Mescolare delicatamente e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per 20 minuti, agitando delicatamente ogni cinque minuti. Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno integrato per neutralizzare la papaina e mescolare delicatamente.

Centrifugare per cinque minuti a 400 g per pellettare i gangli della radice dorsale. Dopo aver pipettato il surnatante, aggiungere un millilitro di collagenasi di tipo IV nella soluzione di Dispase II e incubare nuovamente. Aggiungere 4,5 millilitri di terreno integrato per neutralizzare la soluzione enzimatica, mescolare delicatamente e centrifugare.

Dopo aver pipettato il surnatante, aggiungere cinque millilitri di terreno integrato. Quindi aggiungere Dnase I per raggiungere una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro. I gangli della radice dorsale dovrebbero ora apparire come un ciuffo sciolto, indicando una digestione completa.

Per la dissociazione meccanica, utilizzare un puntale per pipetta con filtro da 1.000 microlitri per triturare la soluzione dei gangli pipettando su e giù quattro o cinque volte. Passate a un puntale per pipette da 200 microlitri e ripetete la triturazione pipettandola quattro o cinque volte. Filtrare la sospensione torbida risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.

Quindi sciacquare gradualmente il colino con 10 millilitri di terreno per garantire il completo trasferimento delle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata per cinque minuti a 1.000 G per pellettare le cellule. Rimuovere il supporto dal pellet e risospendere il pellet della cella in 500 microlitri di terreno integrato.

Rimuovere eventuali residui di PBS dai pozzetti del vetrino con fondo in vetro a otto pozzetti. Distribuire la sospensione dissociata dei gangli della radice dorsale nei pozzetti rivestiti di collagene e incubare. Utilizzare la microscopia a campo chiaro per monitorare quotidianamente le cellule derivate dai gangli della radice dorsale, valutando la vitalità cellulare e la crescita neuronale Per la co-coltura dell'intero ganglio di topo con le cellule tumorali, aspirare prima il terreno dalle colture DRG a montaggio intero sul vetrino con fondo di vetro a otto pozzetti.

Utilizzando una pipetta, aggiungere delicatamente 200 microlitri di sospensione di cellule tumorali al pozzetto contenente la gocciolina di Matrigel e i gangli della radice dorsale. Incubare il vetrino di co-coltura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Rinfrescare il terreno ogni giorno lavandolo una volta con 200 microlitri di terreno integrato riscaldato e aggiungere 300 microlitri di terreno fresco.

Per la co-coltura dei gangli dissociati e delle cellule tumorali, aspirare i terreni dalle colture DRG dissociate sul vetrino con fondo di vetro a otto pozzetti. Quindi distribuire delicatamente 200 microlitri di sospensione di cellule tumorali in ciascun pozzetto prima dell'incubazione. L'insediamento di DRG è stato meno efficiente in assenza di integratori e l'estensione dei neuriti è stata notevolmente ridotta.

I DRG a montaggio intero di animali più anziani hanno prodotto un'estensione neuritica meno abbondante e più distinguibile e cellule gliali minime, facilitando la visualizzazione delle interazioni delle cellule tumorali nervose. La dissociazione dei neuroni DRG utilizzando due passaggi enzimatici ha portato a un maggiore recupero dei neuroni. Entro 24 ore dalla coltura, le cellule non neuronali, come le cellule di schwan, i macrofagi e i fibroblasti, sono diventate evidenti, mentre sono stati osservati neuriti che spuntano da cellule derivate da DRG e sono ulteriormente aumentati dopo 72 ore.

Le cellule tumorali seminate negli inserti transwell rivestiti di Matrigel hanno invaso le cellule HEC293, ma non i neuroni DRG dopo 24 ore di incubazione. Le colture DRG a montaggio intero immerse in una gocciolina di Matrigel hanno permesso l'estensione dei neuriti verso l'esterno attraverso la matrice verso la periferia. Con un attento posizionamento del DRG al centro della gocciolina, fornisce la massima estensione dei neuriti senza crescere eccessivamente i bordi.

Le cellule tumorali si sono stabilizzate dopo 12 ore di co-coltura attorno al bordo della gocciolina di Matrigel contenente il DRG. Dopo 72 ore di co-coltura, le cellule tumorali avevano invaso il Matrigel e si erano spostate verso il ganglio, con un'interazione diretta tra le estensioni delle cellule gangliari della radice dorsale e le cellule tumorali osservate. La co-coltura di cellule derivate da DRG dissociate con cellule tumorali ha permesso una visualizzazione dettagliata delle interazioni delle singole cellule.