Fabbricazione di una matrice cerebrale espandibile personalizzabile in tutte le fasi dello sviluppo

Fabbricazione di una matrice cerebrale espandibile personalizzabile attraverso le fasi dello sviluppo, da parte di Chapman e colleghi dell'Università del Kentucky a Lexington, Kentucky. Lo sviluppo del cervello del maialino è molto simile a quello del cervello umano sotto diversi aspetti. Rispetto a ratti e topi, il rapporto tra il peso cerebrale dei maialini dalla nascita e la maturità è molto più vicino a quello umano e le regioni funzionali dei cervelli gyri e cefalici umani sono molto simili.

Per questi motivi, l'uso di maiali e altri grandi mammiferi nella ricerca neuroscientifica è in aumento. Tuttavia, le matrici cerebrali commerciali per mammiferi di grandi dimensioni sono costose e le scelte sono spesso limitate a una singola dimensione o piano di sezione. Di conseguenza, le matrici commerciali potrebbero non offrire una buona adattazione per diversi ceppi, sia maschi che femmine, e per età diverse.

Questo è particolarmente problematico per gli studi sulle neuroscienze dello sviluppo, in cui le dimensioni del cervello cambiano notevolmente con la crescita postnatale. Ad esempio, i cervelli dei maialini crescono rapidamente nei primi tre mesi, aumentando di volume di oltre il triplo. La matrice cerebrale commerciale dei maialini è progettata per adattarsi ai cervelli dai maialini solo fino a due settimane di età.

Qui presentiamo un metodo personalizzabile di costruzione matriciale basato su lastre acriliche come soluzione economica e facile da implementare a questo problema. Per questo esperimento furono ottenuti quattro maiali ingenui di quattro giorni. Uno è stato utilizzato per il prelievo cerebrale a cinque giorni di età, due a 32 giorni e uno a 38 giorni di età.

Dopo la rimozione del cervello dal cranio, il cervello veniva fissato a immersione in formalina tamponata al 10% per due giorni, e posto in una soluzione al 30% di saccarosio per cinque giorni per la crioconservazione. Presenteremo poi come realizzare un gesso del cervello usando il gel di agarosio. Il primo passo per creare la matrice è creare uno stampo del cervello.

Illustreremo il processo per creare uno stampo di un cervello di maialino postnatale al quinto giorno, che sarà utilizzato per costruire una matrice sagittale. Metti una striscia di plastica resistente sul fondo del contenitore di vetro, assicurandoti di lasciare entrambe le estremità sporgere dai bordi del contenitore. Questa striscia renderà più facile l'estrazione del blocco di agarosio.

Immergi il contenitore circa a metà in un secchio di ghiaccio bagnato. In un becher di vetro, riscalda 150 millilitri di PBS a 90 gradi centigradi e aggiungi sei grammi di agarosio, mescolando costantemente. Versa lentamente la soluzione al 4% di agarosio per creare uno strato di mezzo a un centimetro sul fondo del contenitore e lascia che si solidifichi.

Ricoprire completamente il cervello con uno strato sottile di olio minerale per evitare che l'agarosio si leghi alla superficie cerebrale o rimanga intrappolata nei solci. L'olio rende anche molto più gestibile la rimozione del cervello dal gel di agarosio. Una volta rivestito, posizionare il cervello sul sottile strato di agarosio nell'orientamento desiderato per una muffa coronale o sagittale il più dritta e eretta possibile.

Lascia raffreddare la soluzione di agarosio a 50 gradi Celsius mescolando costantemente per mantenere una viscosità versabile. Poi versa la soluzione di agarosio sul cervello finché non è completamente incorporata. Lascia che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.

Taglia lo strato di agarosio sopra il cervello con una sonda chirurgica seguendo il contorno cerebrale. Una volta completata la taglienza intorno al cervello, usa una spatola sottile per sollevare delicatamente lo strato superiore dell'agarosio. Fai attenzione a non tagliare o graffiare il cervello durante questi passaggi.

Rimuovi delicatamente tutto il cervello dallo stampo. Dovrebbe uscire relativamente facilmente grazie all'olio minerale applicato in superficie in precedenza. Assicurati di rimuovere eventuali piccoli pezzi di gel di agarosio che potrebbero essere caduti nell'impronta.

Riscalda 98 millilitri di PBS in un becher a 9 gradi Celsius e aggiungi quattro grammi di agarosio e due millilitri di inchiostro indiano. Mescola bene. Versa questa soluzione di agarosio nero nell'impronta prodotta dal cervello, facendo attenzione a non traboccare l'impronta.

Lascia che il gel nero si solidifichi. Tieni entrambe le estremità della striscia di plastica e solleva l'intero blocco di agarosio dal contenitore. Ora illustreremo come creare piastre modello per la tua matrice.

Per tagliare lo stampo per cervello, posiziona un foglio di carta in scaglie tra due piastre acriliche trasparenti da 76 millimetri e posizionale vicino al bordo del tavolo. Poi usa delle morsetti per fissare quattro quadrati d'angolo e due piastre di acrilico, così da costruire due pareti che tengano saldamente i blocchi di agarosio nell'orientamento desiderato. I bordi frontali dei due quadrati metallici agli angoli e delle due lastre verticali in acrilico dovrebbero essere allineati lungo un lato della carta a scala.

Posiziona il blocco gel di agarosio in modo che il bordo da tagliare si allinei lungo la carta a scaglie e con i bordi delle lastre acriliche verticali e dei quadrati agli angoli, e posiziona un peso sul lato opposto del blocco di agarosio per tenerlo in posizione. Taglia qualsiasi eccesso dal blocco finché il cast cerebrale in inchiostro indiano non è quasi tagliato. Sposta il blocco di agarosio in avanti ai passaggi desiderati, ad esempio di due o cinque millimetri con l'aiuto delle marcature sulla carta della bilancia sottostante.

Afferra saldamente la lama con entrambe le mani e guidala lungo i bordi anteriori sia delle piastre acriliche che dei quadrati agli angoli per tagliare il blocco. Posiziona ogni fetta su un secondo foglio di carta a scaglia e premi con decisione per trasferire un'impronta sulla carta. Con una penna, delinea l'intera fetta.

Rimuovi la fetta e contorna il contorno cerebrale identificato dall'inchiostro indiano. Nota l'orientamento della prima fetta sulla carta a scala, ad esempio posteriore e anteriore per le sezioni sagittali, e mantieni la costanza quando vengono aggiunte ulteriori fette di gel durante il processo. Numeri ogni tracciamento in sequenza.

Taglia le lastre acriliche a 10 per 8 1/2 centimetri. Poi impilale e fissale alla fase di un trapano a colonna usando quadrati d'angolo e morsetti. Forare tre fori nella pila con le coordinate indicate nel manoscritto.

Rimuovi la pellicola protettiva dalle lastre acriliche. Poi posiziona una lastra acrilica sopra un modello sulla carta a scaglie e allinea la parte superiore delle linee della lastra acrilica ai bordi superiori del modello. Traccia il contorno del cervello sulla piastra acrilica con un pennarello permanente.

Etichetta ogni targa per farla corrispondere al numero del modello o al brain tracing. Usando la sega a nastro, taglia ogni lastra lungo le linee del modello copiato. In alternativa, uno strumento rotante con punta da intaglio del legno può essere usato per rimuovere le aree indesiderate.

Lucida il filo di taglio usando uno strumento rotativo con una punta abrasiva per levigarne i bordi, poiché i bordi affilati potrebbero danneggiare il cervello durante le fette. Ricontrolla la precisione del taglio posizionando la lastra acrilica sopra il modello. Rifiniture e lucida se necessario.

Successivamente, illustreremo l'assemblaggio delle lastre. Preassemblare la matrice impilando le lastre in ordine sequenziale e controllare l'allineamento delle lastre. L'assemblaggio a matrice inizia inserendo tre lunghi bulloni in acciaio inox attraverso la prima piastra acrilica e poi posizionando una rondella su ogni viti.

Metti la seconda piastra e aggiungi rondelle a ogni viti. In alternativa, le rondelle possono essere incollate intorno ai fori di ancoraggio con della supercolla per evitare di dover aggiungere le rondelle singolarmente durante ogni assemblaggio. Ripeti questo processo finché tutte le piastre non sono state aggiunte in sequenza ai bulloni.

Stringi tutto insieme con un dado su ogni bullone. Esegui una lucidatura finale dei bordi rivolti verso il cervello per ottenere una transizione più fluida da una piastra all'altra. Usa pennarelli di colori diversi per colorare il bordo superiore delle lastre acriliche con colori alternati per rendere molto più facile la taglienza.

Qui alternavamo targhe nere, rosse e senza segni. Infine, dimostreremo il processo di taglio del cervello sia nel piano coronale che nel piano sagittale. Per tagliare il cervello, posizionalo nella matrice nella stessa orientazione in cui era durante il processo di modellatura e il più dritto possibile.

Avrai bisogno di una lama larga e piatta per tagliare il cervello. La lama larga limita il rischio di torsioni o piegatura durante il taglio. Consigliamo una lama criostatica ad alto profilo.

Per sicurezza, avvolgi una lunghezza di circa due centimetri di un'estremità della lama con del nastro da laboratorio per creare uno spazio in cui tenere in sicurezza l'estremità avvolta durante il taglio del cervello. Una nota di cautela qui. Poiché ogni parte del cervello ha texture diverse dopo la fissazione della formalina, bisogna fare attenzione ad applicare una pressione uniforme sulla lama.

Inoltre, il cervello del maialino è grande, quindi è meglio usare un movimento di taglio per tagliare il cervello piuttosto che un taglio diretto che preme verso il basso. La lama dovrebbe essere tirata con forza costante da un lato all'altro, assicurandosi di andare abbastanza in basso da tagliare tutto il cervello. Metti tutte le fette in una piastra a sei pozzi o in un vassoio in acciaio inox riempito di PBS.

Posiziona con cura le fette nella teglia, mantenendo l'ordine e l'orientamento delle fette, e conserva o procedi secondo necessità. Per regolare la geometria o espandere la cavità per adattarla meglio al cervello, si possono rimuovere o aggiungere alcune lastre acriliche selezionate per adattare la matrice a diverse dimensioni cerebrali. Qui illustriamo l'espansione di una matrice sagittale costruita per un cervello di maialino P5 aggiungendo diverse lastre, qui colorate di blu e verde, alla parte centrale della matrice.

La matrice è ora adatta per la sezionazione sagittale di un maialino P38. La capacità di espandere o ridurre la dimensione della matrice aumenta notevolmente la flessibilità della matrice e può risparmiare sia materiali che sforzo. Come per il taglio coronale, si taglia con cura il cervello nel piano sagittale usando placche successive per guidare la lama.

Il sistema di codifica a colori aiuta a identificare la corretta posizione sequenziale della lama, cosa difficile quando le fette sono sottili. Rimuovi il cervello dalla matrice e separi delicatamente le fette. In conclusione, abbiamo sviluppato un metodo semplice, economico e flessibile per creare matrici cerebrali per i maialini neonatali.

Questo concetto può essere applicato a maiali anziani e ad altri modelli animali di grandi dimensioni.