Progressi nella profilazione metabolica degli sferoidi tridimensionali dei tumori cerebrali per lo screening dei farmaci

La ricerca mira a ottimizzare la formazione di radici cellulari 3D per lo studio del metabolismo energetico utilizzando la tecnologia Seahorse, concentrandosi sull'attività metabolica comportamentale cellulare e sulle risposte ai farmaci nel nostro modello clinicamente rilevante. Questi risultati miglioreranno i modelli di colata dei farmaci fornendo una rappresentazione più accurata dei tumori cerebrali, migliorando la valutazione della terapia e l'analisi metabolica per migliori strategie di trattamento. I risultati hanno aperto la strada allo studio di come il metabolismo energetico si altera nei modelli sferoidi 3D, di come i farmaci escono dagli effetti sulle vie metaboliche e dei meccanismi attraverso i quali i cambiamenti metabolici contribuiscono allo sviluppo della resistenza tumorale alla terapia.

Dopo aver risospeso le celle U87 raccolte in DMEM, preriscaldare il terreno inutilizzato a 37 gradi Celsius. Mantenere le sospensioni cellulari a temperatura ambiente per 30 minuti. Sulla base della conta cellulare iniziale, diluire la sospensione cellulare con DMEM contenente il 10% di FBS fino a un volume finale di 20 millilitri, garantendo circa 200.000 cellule.

Miscelare accuratamente la sospensione cellulare finale mediante inversione ripetuta. Aggiungere lentamente 200 microlitri di sospensione lungo il bordo di ciascun pozzetto in una piastra trasparente a fondo tondo con attacco ultra-basso a 96 pozzetti, quindi sigillare ermeticamente la piastra con Parafilm per evitare perdite durante la centrifugazione. Posizionare la piastra sigillata nella centrifuga e far funzionare a 200 G per due minuti per pellettare le celle sul fondo di ogni pozzetto.

Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Rimuovere con cautela il Parafilm e posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per preparare una soluzione di rivestimento, sciogliere cinque milligrammi di poli-D-lisina in 50 millilitri di acqua sterile e mescolare accuratamente la soluzione, fino a completa dissoluzione.

Aggiungere 30 microlitri della soluzione di rivestimento a ciascun pozzetto della piastra del saggio metabolico. Assicurarsi dell'assenza di bolle agitando delicatamente la piastra o aspirando la soluzione in eccesso. Incubare la piastra con il coperchio per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione di rivestimento e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di acqua sterile.

Asciugare la piastra all'aria per almeno 30 minuti, quindi riscaldare la piastra a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 30 minuti per stabilizzare il rivestimento. Successivamente, aggiungere 175 microlitri di terreno preriscaldato a ciascun pozzetto. Conservare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di anidride carbonica, fino a quando non è pronta per il trasferimento degli sferoidi cellulari.

Trasferire le piastre sferoidi in un sistema di imaging ad alto contenuto dopo cinque giorni di coltura. Per configurare i parametri di imaging, impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e il livello di anidride carbonica su 5%Regolare il tipo di piastra, i canali e l'intervallo di messa a fuoco nelle impostazioni del sistema. Successivamente, acquisisci immagini sferoidi utilizzando un microscopio confocale con obiettivi 10 volte e il software di imaging, quindi identifica i pozzetti contenenti sferoidi intatti e registra le loro posizioni per il trasferimento.

Assegnare gli sferoidi intatti a due gruppi, un gruppo di controllo con sei pozzetti replicati e un gruppo di trattamento con sei pozzetti replicati per il trattamento con fenofibrato. Preparare la soluzione di lavoro del fenofibrato in un terreno di preriscaldamento fresco alla concentrazione ottimale. Rimuovere con cautela lo sferoide contenente la piastra a basso attacco dal sistema di imaging e posizionarla su una superficie sterile all'interno di una cappa di biosicurezza.

Posizionare la piastra del saggio rivestita di poli-D-lisina adiacente ad essa per il trasferimento, quindi tagliare la punta di una pipetta da 20 microlitri per consentire un'aspirazione delicata degli sferoidi cellulari senza causare danni. Utilizzando la punta della pipetta tagliata, aspirare delicatamente ogni sferoide intatto dal fondo del suo pozzetto. Trasferire ogni sferoide nel pozzetto corrispondente della piastra rivestita e lasciarlo riposare per 20 secondi.

Trasferire le piastre per il saggio degli sferoidi 3D a un sistema di imaging ad alto contenuto. Per analizzare i dati morfologici, applicare il modulo della regione texture per separare grossolanamente gli sferoidi 3D dallo sfondo dividendo il contenuto dell'immagine in tre cluster in base alle caratteristiche della texture. Applica il modulo Trova regione immagine per perfezionare la separazione degli sferoidi 3D preisolati utilizzando le caratteristiche dimensionali basate sul volume, assicurando che le impurità vengano rimosse e che gli sferoidi intatti vengano mantenuti.

Misura i parametri morfologici degli sferoidi 3D utilizzando il modulo delle proprietà morfologiche. Applica il modulo di selezione della popolazione per filtrare e conservare solo gli sferoidi cellulari 3D autentici, quindi esporta i risultati dei dati morfologici. Gli sferoidi si sono formati visibilmente entro il quinto giorno di coltura, mantenendo una morfologia sferica uniforme in tutti i campioni osservati.

Il quinto giorno è stato osservato anche uno sferoide disintegrato con integrità strutturale visibilmente interrotta. L'analisi post-trasferimento ha rivelato che sia gli sferoidi di controllo che quelli trattati con fenofibrato sono rimasti intatti nella maggior parte dei casi, ma alcuni sferoidi trattati con fenofibrato sono stati disintegrati. Il tasso di consumo di ossigeno è stato significativamente ridotto negli sferoidi trattati con fenofibrato in tutti i punti temporali rispetto al gruppo di controllo.