Modellazione della malattia mitocondriale utilizzando organoidi cerebrali: un focus sull'encefalomiopatia mitocondriale, l'acidosi lattica e gli episodi simili all'ictus

L'obiettivo della nostra ricerca è comprendere i misuratori per le malattie mitocondriali e trovare farmaci per trattarla. La sfida è mantenere la capacità per saghi ad alta produttività, anche se la tecnica prevede la formazione di organoidi. Per cominciare, rimuovere il mezzo dalle placche di coltura pluripotente indotta quando sono circa al 70-80% di confluente.

Lava le cellule con PBS. Aggiungi 350 microlitri di soluzione enzimatica alle cellule e incuba. Aggiungi 800 microlitri di medium di adattamento a gambo per fermare la reazione.

Dopo aver trasferito la sospensione della cella in un tubo fresco, centrifugarla a 190G per cinque minuti a 22 gradi Celsius. Successivamente, risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di differenziazione. Dopo aver contato le cellule, semina 3000 cellule in 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra di attacco a forma di U a 96 pozzi bassi.

Incubare per sei giorni a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al 5%. Dopo l'incubazione, si utilizza una pipetta a foro ampio per trasferire gli organoidi dalla piastra dei 96 pozzi a un vaso da 10 centimetri. Pipetta 50 microlitri di medium DMEM/F12 integrato in ciascun pozzo di una nuova piastra da 96 pozzi.

Raccogli gli organoidi in tubi da due millilitri. Rimuovere il mezzo con attenzione senza aspirare gli organoidi e aggiungere 1,5 millilitri di mezzo DMEM/F12 integrato. Dopo aver pipetato l'ultimo lavaggio, aggiungi 500 microlitri di mezzo fresco.

Poi trasferisci gli organoidi in un piatto da 10 centimetri. Aggiungi cinque millilitri di mezzo per facilitare la selezione di ogni organoide. Trasferire tutti gli organoidi in ciascun pozzo di una piastra da 96 pozzi utilizzando una micropipetta impostata a 50 microlitri e incubare per tre giorni.

Al nono giorno, raccoglie gli organoidi in tubi da due millilitri e lava tre volte con DMEM/F12. Poi si risospendono gli organoidi nel mezzo di differenziazione. Trasferire circa 10 organoidi per pozzo in una piastra a sei pozzi e regolare il volume finale di mezzo in ciascun pozzo a due millilitri.

Coltiva la lastra staticamente per sei giorni a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Il quindicesimo giorno, raccogliere gli organoidi in tubi da 15 millilitri. Dopo aver lasciato sedimentare i tubetti, aggiungere un nuovo mezzo di differenziazione integrato con B27 e vitamina A dopo aver pipetato il surnadante.

Trasferire circa 10 organoidi per pozzo in una piastra a sei pozzi. Coltivare l'organoide staticamente per 15 giorni a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Ricoprire le piastre di coltura con la soluzione diluita di poli-L-Ornithina.

Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, lava i pozzi tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS. Ora aggiungi una soluzione di laminina diluita ai pozzi.

Incubare le piastre per tre ore a 37 gradi Celsius, o durante la notte. Centrifuga la sospensione organoide a 200G per cinque minuti. Rimuovi il soprantantante e aggiungi un millilitro di soluzione enzimatica.

Mescola bene e incuba a 37 gradi Celsius per cinque minuti prima di centrifugare. Dopo aver rimosso il surnante e aggiunto un millilitro di soluzione di dispersione, sovrapporsi con cura la soluzione isolante sotto la sospensione. Poi centrifuga la sospensione a 200G per cinque minuti.

Ora, pipetta un millilitro di mezzo neuronale nel tubo. Mescola la soluzione e fai passare la sospensione attraverso un colino da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Dopo aver contato le cellule, si semina la sospensione cellulare a una densità di 100.000 cellule per centimetro quadrato su piastre rivestite di poli-L-Ornitina e laminina.

Sostituisci il medium ogni quattro-sette giorni fino al giorno 60. Per fissare gli organoidi per l'immunofluorescenza, si prelevano prima gli organoidi in microtubi. Risciacquare gli organoidi con PBS, poi fissare gli organoidi al 4% di paraformaldeide per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la fissazione, lava gli organoidi fissi tre volte con PBS. Conservare gli organoidi a quattro gradi Celsius fino all'uso. 30 giorni dopo la semina per la coltura neuronale 2D, rimuovere il mezzo di coltura dalle placche.

Poi lava le cellule con PBS. Fissare le celle con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Svuota il paraformaldeide, poi lava le cellule con PBS tre volte.

Conservare le celle fisse a quattro gradi Celsius fino all'uso. Per raccogliere gli organoidi per RTQPCR, trasferire gli organoidi in microtubi. Pipetta PBS nei tubi per lavare gli organoidi.

Ora, aggiungi 350 microlitri di tampone di lisi agli organoidi, poi congelali bruscamente in azoto liquido. Conserva i tubi a meno 80 gradi Celsius fino a quando non vengono usati. Gli organoidi cerebrali contenenti neuroni positivi a FOXG1 sono stati indotti con successo dalla linea IPSC sana di controllo 414C2 al giorno 30, mentre reti neurali coltivate in 2D sono state ottenute al giorno 60.

I livelli di eteroplasmia della variante M.3243A a G sono stati confermati dalla QPCR. Le linee dalla seconda all'otto avevano una bassa eteroplasmia, e le linee dalla seconda alla sesta avevano un'elevata eteroplasmia. Gli organoidi cerebrali derivati dalla linea di eteroplasmia bassa da due a otto hanno mostrato dimensioni e morfologie simili a quelle dei controlli sani.

Gli organoidi generati dalla linea ad alta eteroplasmia due a sei mostravano dimensioni ridotte di 0,3 millimetri quadrati e morfologia irregolare con un valore di circolarità di 0,82. La maggior parte dei neuroni indotti dalla linea 414C2 e dalla seconda all'ottava linea erano positivi a FOXG1 nei giorni 30 e 60. I neuroni FOXG1 positivi sono stati raramente rilevati in organoidi o in neuroni in coltura 2D derivati dalla linea due-sei.

I nostri risultati suggeriscono che i modelli organoidi basati su IPSC derivati dal paziente rappresentano una piattaforma utile per studiare specchi, meccanismi e per lo screening farmacologico. I nostri metodi convenzionali, con tempi di coltura brevi e efficacia in termini di costi, offrono strumenti pratici per indagare la fisiopatologia del MELIS. Vorremmo cercare potenziali farmaci per il MELIS utilizzando composti con la somministrazione organizzata dal paziente in futuro.