Caratterizzazione della secrezione di vescicole extracellulari derivate da adipociti utilizzando un modello murino con reporter CD63-GFP in vivo e in vitro

Studiamo vesicole extracellulari derivate dagli adipociti, le EV, per definire i loro ruoli nel tessuto adiposo, in particolare come regolano la comunicazione tra gli adipociti maturi e le loro cellule progenitrici. Attualmente non esistono sistemi in vivo per studiare le secrezioni degli EV degli adipociti, e i protocolli di purificazione esistenti non sono ancora completamente ottimizzati. Per cominciare, si utilizza la tecnica sterile per rimuovere il tessuto adiposo inguinale dai topi soppressi.

Inserire un grammo di tessuto in un tubo da due millilitri contenente 0,5 millilitri di buffer digestionale. Usando forbici sterili, trita il tessuto in pezzi non più grandi di un millimetro. Sospendere il tessuto tritato in 10 millilitri di tampone digestionale contenente 0,5 milligrammi per millilitro di Liberasi e 50 unità per millilitro di DNase I. Incubare il campione a 37 gradi Celsius su un oscillatore orbitale.

Durante l'incubazione, inverti delicatamente il tubo più volte. Quando la soluzione appare torbida e non rimangono frammenti di tessuto visibili, la digestione è completa. Per isolare la frazione stromica vascolare o SVF, diluire la sospensione digerita con due volumi di buffer digestionale.

Inverti delicatamente il tubo tre o quattro volte per mescolarlo bene. Fai passare la sospensione attraverso un filtro sterile da 100 micrometri per rimuovere il tessuto non digerito, poi centrifuga il filtrato a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Etichetta il pellet come SVF.

Incubare la frazione stromale vascolare in un tampone di lisi dei globuli rossi appena preparato su ghiaccio per cinque minuti, protetto dalla luce. Aggiungi due volumi di buffer di lavaggio e centrifuga a 400g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere la frazione stromale vascolare in 80 microlitri di tampone per grammo di tessuto e trasferire il contenuto in un nuovo tubo.

Aggiungi 20 microlitri di cocktail di esaurimento dei progenitori non adipociti per ogni grammo di tessuto. Incubare il campione per 15 minuti a due o otto gradi Celsius al buio. Fai passare il campione attraverso una colonna LS e raccogli il flusso che contiene la frazione cellulare negativa per la linea di discendenza.

Centrifugare il flusso a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere le cellule progenitrici degli adipociti. Incubare 250 microlitri di cellule progenitrici di adipociti di topo isolati su vetrine a otto pozzi rivestite di collagene per sei ore. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti per preservare le strutture vescicole cellulari ed extracellulari per l'imaging.

Successivamente, lava le vetri tre volte con PBS, poi monta con un medium anti-sfumo. Successivamente, dopo aver contato le cellule progenitrici degli adipociti, sospenderle e diluire il colorante di vitalità. Incubare sul ghiaccio per 20 minuti, protetto dalla luce.

Lava le celle una volta con il tampone di lavaggio e centrifuga. Sospendere le cellule in un tampone di colorazione brillante in modo che la concentrazione finale sia di 1 milione di celle ogni 100 microlitri. Bloccare il legame non specifico aggiungendo un reagente bloccante del recettore Fc con un rapporto uno a 100 e incubare.

Fai girare liberamente l'anticorpo SCA-1 a 6000g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere l'anticorpo SCA-1 al tubo APC con una diluizione da uno a 100, poi mettere il tubo sul ghiaccio, protetto dalla luce. Lava le cellule due volte con un millilitro di tampone di lavaggio, poi centrifuga a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Sospendere le cellule in wash buffer per l'ordinamento della citometria a flusso, poi acquisire i dati per le cellule SCA-1 e positive a GFP su un citometro di flusso spettrale dotato di laser viola e blu. Per iniziare la differenziazione, ricopri i piatti con lo 0,2% di gelatina, per 30 minuti a temperatura ambiente. Seminare APC appena isolati in mezzo DMEM/F12 integrato e incubare fino alla confluenza.

Sostituisci il mezzo dal primo al giorno ottavo con il mezzo di differenziazione adipogenica MesenCult. Al nono giorno, lavare gli adipociti due volte con PBS, poi sostituire il mezzo con un substrato maturo per la coltura degli adipociti contenente DMEM 1%BSA e 0,2% Primocina. Per isolare vescicole extracellulari secrete dagli adipociti, si passa prima 15 millilitri di mezzo di coltura attraverso un filtro da 40 micrometri, seguiti da un filtro da 30 micrometri.

Centrifuga il filtrato a 500g per cinque minuti, poi centrifuga il soprantantante a 2000g per 10 minuti per rimuovere eventuali cellule residue e detriti. Dopo aver fatto passare il surnatante risultante attraverso un filtro da 0,8 micrometri e aver trasferito il filtrato in un'unità di ultrafiltrazione da 15 millilitri, centrifugare a 4000g per 15 minuti per concentrare il mezzo. Carica il campione concentrato su una colonna di cromatografia di esclusione di dimensioni collegata a un collettore automatico di frazioni e raccogli le frazioni F1 fino a F8.To eseguire l'analisi Western blot, concentrando ogni frazione da 400 a 25 microlitri.

Pipetta 50 microlitri di tampone per il saggio di immunoprecipitazione radiointegrata con proteasi e inibitori della fosfatasi al concentrato. Aggiungere 75 microlitri di due buffer di caricamento SDS 2X per denaturare il campione e risolvere proteine su un gel di Tris-Glicina dal 4%-12%. Per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, diluire i campioni di vescicole extracellulari con PBS sterile filtrato da 0,1 micrometri e mescolare delicatamente.

Carica il campione diluito nello strumento NTA dotato di una telecamera semiconduttore scientifica complementare ad ossido metallico ad alta sensibilità e di un laser verde da 532 nanometri. Impostare la rilevazione per particelle tra 10 nanometri e 1.000 nanometri, e entro una concentrazione da 10 fino alla potenza di sei a 10 fino alla potenza di nove particelle per millilitro. Le cellule progenitrici adipose provenienti da topi stop-flock-storm/CD63GFP non hanno mostrato punti proteici fluorescenti verdi rilevabili sotto microscopia confocale.

Mentre le cellule dei topi AdipCD63 mostravano numerosi punti fluorescenti fluorescenti distinti in tutto il citoplasma. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che l'1,2% delle cellule positive al cranio 1 nei topi reporter ha espresso proteine fluorescenti verdi rispetto al 12,6% nei topi AdipCD63-GFP. Il western blot delle frazioni di cromatografia a esclusione di dimensione ha mostrato che i marcatori vescicoli extracellulari CD63 e HSP70 erano arricchiti nelle frazioni F1 e F2. Mentre i marcatori del reticolo endoplasmatico e dei mitocondri erano assenti, confermando la purezza vesicale.

L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle ha rivelato che le vescicole extracellulari derivate dagli adipociti variavano in dimensioni da 50 a 500 nanometri, e la microscopia elettronica a trasmissione ha confermato che le vescicole presentavano strutture a doppia membrana intatte. Western blot confermato knockout di STX4 negli adipociti. La microscopia confocale ha mostrato che le vescicole CD63-GFP positive erano disperse in tutto il citosolo negli adipociti di tipo selvatico, ma si accumulavano vicino alla membrana plasmatica negli adipociti knockout di STX4.

La concentrazione di vescicole extracellulari derivate dagli adipociti secreti è stata significativamente ridotta negli adipociti knockout STX4 rispetto al tipo selvatico. Western blot di quantità uguali di proteine nelle vescicole intracellulari ha mostrato una riduzione dell'espressione di CD63 e CD81 negli adipociti knockout STX4 rispetto al tipo selvatico. Il protocollo fornisce un sistema robusto e riproducibile per studiare la secrezione EV degli adipociti in vivo e in vitro, oltre a un metodo ottimizzato di purificazione degli EV degli adipociti.

Il protocollo per la prima volta descrive e convalida l'uso di centrifugazioni seriali a bassa velocità combinate con cromatografia a esclusione di dimensione per purificare EV derivati da adipociti maturi. I nostri risultati ci permettono di porre nuove domande su come gli adipociti utilizzino vescicole extracellulari per comunicare con altri tipi cellulari in condizioni fisiologiche e patologiche.