Name: Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-12T19:12:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri la microfabbricazione di chip porosi per la coltura cellulare tridimensionale utilizzando l'impronta a caldo e la microtermoformatura con tecnologia ion track. Questi metodi semplificano la produzione e migliorano la ricerca in biologia cellulare.

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Gli autori desiderano ringraziare Dirk Herrmann, Oliver Wendt, Siegfried Horn, Hartmut Gutzeit, e Joerg Bohn per il loro aiuto fondamentali riguardanti la saldatura vapori di solvente. Inoltre, vorremmo riconoscere Michael Hartmann, Alex Gerwald, e Daniel Leisen per la loro assistenza tecnica.

Processo Sequenza # 1: goffratura a caldo, lavorazione e saldatura di vapore solvente Il CellChip nel suo design cubico è replicato da caldo o goffratura micro stampaggio ad iniezione. Per questo, usiamo uno stampo micromachined ottone con la geometria inversa del chip. I contenitori - disposte in una serie regolare di fino a 1156 contenitori - hanno un design cubico, con una lunghezza dello spigolo di 300 micron. Per goffratura a caldo, il processo di replica viene eseguito su un tradizionale WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Germania). Lo strumento è costituito da due piastre metalliche circolari. In una prima fase, una sottile lastra in PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) si trova nel centro della piastra inferiore dello strumento aperto. L&#39;inserto stampo microstrutturata centrico è montato la piastra superiore. Allora il programma è chiuso per l&#39;evacuazione dello stampo e riscaldato ad una temperatura superiore alla temperatura di transizione vetrosa del polimero. Premendo i piatti insieme, il polimero viscoso viene spinto nelle cavità evacuate fino a quando sono completamente riempito con precisione replicando la geometria dello stampo. Dopo il raffreddamento dello strumento, la parte microstrutturata polimero può essere sformati. Il processo richiede più di massa di polimeri di quanto sia effettivamente necessario per riempire la cavità dello stampo. L&#39;avanzo polimero forma uno strato residuo che può essere utilizzato per facilitare la sformatura del pezzo. Tuttavia, per creare pori di diametro inferiore a 3 micron sul fondo dei contenitori, lo spesso strato residuo deve essere assottigliato verso il basso, o addirittura completamente rimosso e sostituito da una membrana porosa. Per semplificare il processo di integrazione dei pori, la parte posteriore del CellChip replicato viene completamente rimosso dalla lavorazione con un mulino diamante. Per questo, le parti sono fissate su una piastra di raffreddamento di montaggio e, inoltre, le strutture fragili sono congelati in acqua deionizzata per proteggerli da eventuali danni. In una fase di processo scorso, infine, un commerciale ioni traccia incisa a membrana (policarbonato, spessore 10 micron, diametro dei pori 3 micron, 2x10 6 pori / cm ², Pieper Filter GmbH) è legato alla parte posteriore della serie di contenitori ora aperto sia a superiore e inferiore. Il processo di incollaggio è un solvente processo di saldatura vapore eseguito in una tenuta di gas, riscaldato da camera [fig. 1], composto da un pistone superiore e un piatto inferiore mobile con un mandrino vuoto integrato. 4 Fino a quattro CellChips lavorare e tenere traccia incisa a membrane sono esposti in parallelo ad un solvente vaporizzato dopo la camera è stato evacuato. Poi, i pezzi stampati e le membrane sono premuti insieme per lo stantuffo in alto. Dopo un breve periodo di esposizione (&lt;15 s), la camera viene evacuata nuovamente eliminando il solvente. A causa del tempo di contatto breve, solo in prossimità della superficie materiale è sciolto e una deformazione della struttura del blocco a causa del carico meccanico può essere evitato. Infine, la camera è aperta e il CellChips solvente saldato può essere rimosso e preparato per colture cellulari [fig. 2]. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png" alt="Figura 1" width="100" /></a> Figura 1. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png" alt="Figura 2" width="100" /></a> Figura 2. Processo Sequenza # 2: irradiazione di ioni pesanti, microthermoforming e incisione traccia (processo SMART) Il nuovo processo chiamato SMART è una tecnologia sviluppata di recente per la produzione di micro-funzionalizzati membrana come microstrutture. 5 La tecnologia si basa su un processo di termoformatura microtecnica, chiamato &#39;microthermoforming&#39;. 6,7 In questa fase del processo centrale, che è stato adattato dal macroscopico intrappolati processo di termoformatura foglio, una riscaldata sottile pellicola polimerica è formata nella sua ammorbidito, lo stato di gomma elastica di pressione del gas in una cavità dello stampo [fig. 3]. A differenza di goffratura a caldo o stampaggio ad iniezione, questo processo non è una forma primaria e il polimero non è sciolto. A causa del fatto che il film è formato ancora in uno stato solido con una coesione materiale permanente, modifiche materiale con alta risoluzione laterale può anche essere generata a planare film polimerici e sono conservate in tutto il processo di formatura. Dopo il passo microthermoforming, queste modifiche possono essere ulteriormente elaborati selettivamente, per esempio, mediante trattamento chimico. <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_9/Giselbrecht-Fig3.png" alt="Figura 3" width="400" height="217" /> Figura 3 Il processo di SMART in linea di principio si compone di tre fasi del processo: <ol><li> creazione di modelli di modifica altamente deliberato planare film sottili di polimeri in un pre-processo </li><li> 3D Shapzione dei film di microthermoforming senza perdita di (fantasia) modifiche </li><li> post-processo (optional) per una funzionalizzazione finale delle parti microstrutturate pareti sottili </li></ol> Il processo di SMART stiamo applicando per la realizzazione di CellChips poroso comprende le seguenti fasi di processo [fig. 4]. Una sottile pellicola polimerica, per esempio, dal policarbonato (Pokalon OG461Gl, 50 micron, LoFo High Tech Film GmbH, Germania), viene irradiato con ioni pesanti accelerati (come Xe, Au o ioni U) presso le strutture acceleratore del GSI (Darmstadt, Germania) con energie di ca. 1 GeV e fluenze nell&#39;ordine di 106 8 Dopo il raffreddamento dello strumento, la parte con pareti sottili possono essere sformati. ioni / cm ². Quando penetrare attraverso la pellicola, ogni ione produce una scia quasi retta di materiale modificato, chiamato traccia latente. La pre-trattati film sono poi termoformato ad un array di 25x25 microcontainers con pareti sottili, ciascuno con un diametro e una profondità di 300 micron. Il processo è attualmente eseguito su una pressa modificata goffratura a caldo [fig. 5], in cui è bloccato il film polimerico tra due lastre di metallo. La piastra superiore è dotata di stampo microlavorati e quello inferiore contiene la pressione e connettori vuoto. Il film è teso in microcavità preventivamente evacuati dello stampo con azoto con una pressione fino a 5 MPa. I film sono formate vicino alla loro temperatura di transizione vetrosa prevenire traccia ricottura. <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_10/Giselbrecht-Fig4.png" alt="Figura 4" width="400" height="119" /> Figura 4 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png" alt="Figura 5" width="100" /></a> Figura 5 In un post-processo, le tracce di ioni sono selettivamente incise a pori immergendo il tutto in una microstruttura medio incisione appropriato (per esempio, 5 Mol / L di NaOH, il 10% w / v MeOH). Controllando i tempi di incisione e acquaforte condizioni, quali la concentrazione, la temperatura e speciali additivi (ad esempio, promotori etch), la dimensione e la forma dei pori risultante può essere regolato [fig. 6]. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png" alt="Figura 6" width="100" /></a> Figura 6

<ol><li>Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-like+culture+system+using+microstructures%3A+influence+of+extracellular+matrix+material+on+cell+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation.</a> J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Heckele, M., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+micro+molding+of+thermoplastic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+And+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Review on micro molding of thermoplastic polymers.</a> Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+as+a+novel+technique+for+manufacturing+scaffolds+in+tissue+engineering+%28CellChips%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.</li>
<li>Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+thermoforming+of+micro+fluidic+analysis+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).</li>
<li>Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+of+flexible%2C+not+buried+hollow+microstructures+for+chip-based+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).</li>
<li>Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+tracks+in+solids%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nuclear tracks in solids.</a> , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.</li>
</ol>

Anche se i metodi stabiliti di microreplicazione polimero, come micro-stampaggio ad iniezione o goffratura a caldo, sono adatte per la produzione di microstrutture, non sono realmente efficaci nella produzione di microstrutture con un sistema integrato ed altamente porosità controllata, in quanto è necessario per la CellChip. Strutture ingombranti per esempio richiedono lavorazioni costose per ridurre lo spessore della parete per una perforazione laser successivo o pareti devono essere completamente sostituita da track-incise membrane. SMAR...

microfabbricazione di chip di dimensioni ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Utilizzando le tecnologie di microfabbricazione è un prerequisito per creare impalcature della geometria riproducibile e qualità costante per tridimensionali coltivazione delle cellule. Queste tecnologie offrono un ampio spettro di vantaggi non solo per la produzione ma anche per applicazioni diverse. Le dimensioni e la forma dei cluster di cellule formate può essere influenzato da quello relativo all&#39;architettura e riproducibile della microfabbricazione patibolo e, di conseguenza, la lunghezza del percorso di diffusione di nutrienti e dei gas può essere controlled.1 Questo è senza dubbio uno strumento utile per prevenire l&#39;apoptosi e necrosi del cellule a causa di una sostanza nutritiva insufficiente e la fornitura di gas o la rimozione di metaboliti cellulari. Il nostro chip polimero, chiamato CellChip, ha le dimensioni esterne di 2 x 2 cm con una zona centrale microstrutturata. Questa zona è suddivisa in una serie di microcontainers fino al 1156 con una dimensione tipica di 300 m di lunghezza bordo per la progettazione cubi (cp-o cf-chip) o di 300 m di diametro e profondità per la progettazione round (r-chip). 2 Fino ad ora, a caldo o goffratura micro stampaggio ad iniezione (in combinazione con la conseguente lavorazione laboriosa delle parti) è stato utilizzato per la fabbricazione dei chip microstrutturate. In pratica, i micro stampaggio ad iniezione è una delle solo tecniche replica a base polimerica che, fino ad ora, è in grado per la produzione di massa di polimeri microstructures.3 Tuttavia, entrambe le tecniche sono alcune limitazioni indesiderati dovuti al trattamento di un polimero viscoso si fondono con la generazione di pareti molto sottili o integrati attraverso i fori. In caso di CellChip, sottili strati di fondo sono necessari per perforare il polimero e di fornire piccoli pori di dimensioni definite per la fornitura di cellule, ad esempio con terreno di coltura per perfusione microfluidica dei contenitori. Per superare queste limitazioni e per ridurre i costi di produzione, abbiamo sviluppato un nuovo approccio microtecnica sulla base di una down-scalati processo di termoformatura. Per la produzione di chip a parete altamente porosa e sottili di polimeri, si usa una combinazione di irradiazione di ioni pesanti, microthermoforming e incisione pista. In questo cosiddetto processo &quot;SMART&quot; (Modifica substrato e la replicazione di termoformatura) sottili pellicole polimeriche sono irradiati con energica proiettili pesanti di diverse centinaia di MeV introducendo le cosiddette &quot;tracce latenti&quot; Successivamente, il film in uno stato di gomma elastica è formata in tre parti dimensionale senza modificare o ricottura le tracce. Dopo il processo di formatura, attacchi chimici selettivi converte definitivamente le tracce in pori cilindrici di diametro regolabile.

Vi presentiamo due processi per la microfabbricazione di chip polimerici porosi tridimensionali coltivazione delle cellule. Il primo è goffratura a caldo combinato con un solvente processo di saldatura vapore. La seconda utilizza un processo recentemente sviluppato microthermoforming combinata con la tecnologia agli ioni di pista che porta ad una significativa semplificazione di fabbricazione.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

L'impiego di tecnologie di microfabbricazione è un prerequisito per creare scaffold di geometria riproducibile e qualità costante per la coltura cellulare tridimensionale...

Ciao, mi chiamo Stefan Re. Lavoro presso l'Istituto di Interfacce Biologiche e, nel seguente articolo, vedrete il processo di fabbricazione di un impalcatura microstrutturata chiamata ship, e stiamo utilizzando due metodi diversi per produrre questi chip. Attualmente un processo di goffratura cardiaca abbinato a determinati processi successivi e un processo di formatura microtermica, recentemente sviluppato qui presso il centro di ricerca chiamato Squi. Ora ci troviamo in una tenda da camera bianca e ciò che potete vedere qui sul lato destro è una tipica macchina da incapsulamento sottovuoto riscaldata, che utilizziamo per la fabbricazione del chip cellulare microstrutturato. Per prima cosa, introduciamo una matrice microstrutturata.Questo è montato qui su una piastra di questo tipo, e potete vedere due stampi. Questo stampo è realizzato mediante micro lavorazione ed è fatto di resina. Ora sto montando lo stampo con microstruttura nella macchina.Per il processo di hotboxing, utilizziamo lastre polimeriche come questa qui, e in genere impieghiamo policarbonato o PMA per la produzione del chip cellulare. Ora stiamo inserendo la lastra polimerica nella macchina, al centro della piastr

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