Imaging spettroscopico a super-risoluzione delle molecole di DNA utilizzando contrasto intrinseco

La nostra ricerca presenta il primo protocollo per la misurazione degli spettri fluorescenti intrinseci delle molecole di DNA, consentendo di indagare le loro proprietà ottiche native e le caratteristiche correlate alla conferma della sequenza. Questo protocollo sfrutta la fluorescenza endogena per l'imaging spettroscopico del DNA, evitando interruzioni indotte dalla marcatura, errori di collegamento e densità di marcature incoerenti nei metodi esistenti. Per cominciare, si dissolve il campione di DNA in acqua deionizzata priva di nucleasi fino a una concentrazione finale di 100 millimolari.

Prepara cinque aliquote di microlitri della soluzione di DNA stock per minimizzare i cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Conserva i tubi extra contenenti la soluzione di soglia a 4 gradi Celsius. Con una salvietta da laboratorio, pulisci delicatamente un vetrino di vetro.

Pipetta cinque microlitri della soluzione di DNA da 100 millimolari sul vetrino appena pulito e lascia asciugare il campione per una o tre ore per formare un gel di DNA. In una cappa fumi, preparare sia il buffer beta-mercaptoetanolo sia il buffer di imaging DABCO per supportare il fotocommutamento stocastico delle molecole di DNA. Pipetta cinque microlitri del tampone di imaging sul gel di DNA e posiziona un antibbio di copertura sopra il campione.

Se ci sono bolle all'interno del campione coperto, usa una pinzetta per rimuoverle. Ottenere un array di nanobuchi fabbricato contenente buchi di 100 nanometri di diametro, distanziati a quattro micrometri l'uno dall'altro, disposti in otto file e cinque colonne. Accendi il sistema sSMLM e inserisci filtri a larghezza di banda stretta direttamente davanti alla telecamera.

Posiziona il campione di calibrazione sotto un microscopio e accendi la lampada per illuminare il campione. Imposta il tempo di esposizione a 200 millisecondi per tutti i filtri, ma cambialo a 2.000 millisecondi per il filtro da 750 nanometri. Vai su acquisizione e fast time lapse per regolare il numero di fotogrammi a 10 per ogni filtro.

Dopo la calibrazione, carica il campione di gel di DNA sul palco del microscopio con il lato scivolante del coperchio rivolto verso l'obiettivo e apri il software della telecamera per l'acquisizione dei dati. Identifica la posizione Z appropriata utilizzando il sistema automatico di tracciamento della messa a fuoco e regola la messa a fuoco finché non risulta evidente un chiaro lampeggiamento stocastico. Assicurati che l'obiettivo non tocchi il bordo di slittamento del coperchio per evitare perdite di tamponi nell'olio a immersione e interferenze con il tracciamento.

Acquisisci circa 10.000-30.000 fotogrammi con la potenza di illuminazione desiderata e un tempo di esposizione di 30 millisecondi. Dopo l'acquisizione dei dati, permette al software di salvare i dati in formato nd2 di default. Getta il vetrino in un bidone dei rifiuti approvato destinato a vetri rotti o oggetti appuntissimi.

Scartare tutti i buffer rimanenti nel contenitore designato per i rifiuti liquidi chimici secondo le linee guida di sicurezza istituzionali. Apri Fiji e usa il plugin bio formats per caricare la pila di immagini grezze acquisite del campione di DNA. Seleziona l'immagine seguita da stack, Z Project e scegli l'intensità minima come tipo di proiezione per generare la proiezione minima della pila di immagini grezze.

Seleziona il calcolatore d'immagine e sottrai la proiezione minima dallo stack di immagini raw. Salva il dataset sottratto in background come file TIF per l'analisi spettrale. Successivamente, esegui l'identificazione della localizzazione sullo stack di immagini raw di ordine zero utilizzando il plugin ThunderSTORM versione 1.3.

Imposta la soglia a 1,2 volte l'onda di deviazione standard. F1, adattando il raggio a tre, e sigma a 1,5 per ricostruire l'immagine di ordine zero ed estrarre le coordinate degli eventi di emissione. Per la pila di immagini raw di ordine zero ritagliata, seleziona il plugin seguito da ThunderSTORM ed esegui l'analisi.

Usa Fiji e il software open source RainbowSTORM con versione MATLAB più recente di 2020b per elaborare i dati di calibrazione e ottenere la relazione tra spostamenti orizzontali e verticali e lunghezze d'onda. Esegui l'identificazione della localizzazione sulle immagini di calibrazione delle cinque lunghezze d'onda utilizzando il plugin ThunderSTORM. Imposta la soglia a cinque volte la deviazione standard, onda.

F1, raggio di adattamento a tre, e sigma a 1,5 per ricostruire le localizzazioni dei nanohole di ordine zero e le corrispondenti localizzazioni spettrali di primo ordine. Ottieni un'immagine media di ogni data di calibrazione e regola la soglia entro un intervallo da cinque a dieci volte l'onda di deviazione standard. F1 fino a 80 localizzazioni vengono ottenute per ogni immagine di calibrazione.

Esegui RainbowSTORM e clicca su sfoglia sotto calibrazione spettrale per caricare i file CSV per ogni lunghezza d'onda di calibrazione. Poi clicca sul salvataggio del file di calibrazione per memorizzarlo. Usa uno script Python personalizzato versione 3.11.7 per estrarre i dati dell'intero spettro.

Poi imposta i percorsi file corretti nello script Python per la pila di immagini sottratte sullo sfondo in formato TIF dal precedente passaggio di sottrazione dello sfondo. Imposta il percorso del file per il file CSV di localizzazione prodotto dalla fase di analisi di localizzazione e il file di calibrazione in formato MAT generato dalla fase di calibrazione. Poi si imposta lo spostamento orizzontale a 925-984 pixel per i dati da 532 nanometri acquisiti con un DWP 3D corrispondente a una finestra spettrale da 525 a 750 nanometri per garantire una copertura oltre il range del filtro da 590 a 650 nanometri.

Regolare lo spostamento verticale a 23 pixel sia per i dati da 488 nanometri che per quelli da 532 nanometri acquisiti con il DWP 3D basandosi sulla curva di calibrazione spettrale ottenuta con RainbowSTORM. Infine, linearizzare lo spettro non lineare utilizzando un adattamento polinomiale di terzo ordine per un'analisi successiva di confronto e classificazione. È stata eseguita la calibrazione spettrale, permettendo di misurare i corrispondenti spostamenti orizzontali e verticali dei pixel tra le immagini di ordine zero e quelle di primo ordine.

Questo permetteva di mappare una curva di calibrazione tra la posizione del pixel e la lunghezza d'onda. Gli spettri di emissione non lineari e quelli convertiti sotto eccitazione a 532 nanometri sono stati ottenuti per GC alter, che si riferisce a un tipo di molecola di DNA a doppio filamento. La curva verde rappresentava lo spettro medio.

Gli spettri di emissione non lineari e lineari convertiti di A10C10, un tipo di molecola di DNA a singolo filamento, sono stati ottenuti sotto eccitazione di 488 nanometri con la curva blu che rappresenta lo spettro medio. Questo protocollo consente ai ricercatori di misurare spettri fluorescenti intrinseci di molecole di DNA sintetizzate a singolo e doppio filamento con imaging spettroscopico a super risoluzione. Individuare con precisione la corretta posizione Z è fondamentale, poiché i campioni di gel di DNA mancano di informazioni strutturali e richiedono una concentrazione attenta per osservare i lampeggiamenti stocastici.

I lavori futuri possono estendersi alla misurazione della fluorescenza intrinseca dell'RNA e della proteina, integrando modelli computazionali per la previsione delle sequenze e l'imaging con cromatina libera di marcatura.