Procedura accessibile di sigillatura chip-membrana in silicone per un legame flessibile e affidabile
20 marzo 2026
Un nuovo protocollo di sigillatura per produrre sigilli impermeabili a base di silicone per membrane di dispositivi a chip polidimetilsilossano (PDMS). Destinato a laboratori, configurazione di modelli di chip e sviluppo di piattaforme chip su piccola scala. Dimostriamo il protocollo utilizzando membrane tissutali plastiche e native. Questa procedura richiede solo PDMS, toluene, muffa, membrana e una camera a vuoto.
Miriamo a colmare una lacuna nel design organ-on-chip, fornendo una nuova procedura di sigillatura per dispositivi PDMS con membrana porosa. Attualmente, la sigillatura dei chip è impegnativa, ma il nostro processo spinge il silicone attraverso i pori della membrana, il che significa che si tratta solo di legami silicone-silicone. Se la membrana è porosa, come per un polmone o un intestino su chip, allora sono necessari solo PDMS, toluene e un vuoto.
Per cominciare, miscela accuratamente la base liquida di PDMS con l'agente di polimerizzazione in un rapporto di 10 a 1. Utilizzando una camera a vuoto, degassare la miscela finché tutte le bolle d'aria non vengono rimosse. Utilizzando una siringa a ugello largo, riempi gli stampi preparati con la miscela PDMS degassata.
Posizionare gli stampi riempiti in una camera a vuoto e degas per circa 10 minuti finché tutte le bolle non vengono rimosse. Usando un forno a secco, polimerizza le muffe per due ore a 65 gradi Celsius. Dopo l'indurimento, rimuovere le semi solide degli stampi usando un bisturi.
Ritaglia le sparature dai bordi di ogni parte del chip. Poi si utilizza un punzone per biopsia per aggiungere quattro prese nella metà superiore a ciascuna estremità della camera e ai due anelli adiacenti, indicando le posizioni delle prese inferiori della camera. Posiziona uno stencil stampato in 3D sopra una membrana PET o PC.
Usando un bisturi, taglia la membrana a forma tenendo saldamente lo stencil in posizione. In alternativa, prepara una membrana ECM estratta e disidratala. Posiziona lo stencil sopra la membrana e ritaglialo in forma tenendo fermamente lo stencil in posizione.
Indossa occhiali protettivi e guanti in nitrilo. Mescola PDMS liquido con toluene in un rapporto 7 a 5 per preparare la morta. Usando una siringa a ugello largo, mescola accuratamente con la siringa su e giù fino a ottenere una regolarità.
Mettere tutti i materiali di laboratorio utilizzati per la manipolazione del toluene in una cappa per 24 ore per permettere l'evaporazione. Smaltire i materiali in contenitori approvati e etichettati tramite servizi specialistici per i rifiuti. Ora usa una punta di pipetta per applicare rapidamente la malta PDMS preparata sulla superficie della metà chip dove verrà posizionata la membrana.
Usando pinze pulite, tieni la membrana preparata a un'estremità. Posiziona la punta della membrana sulla malta umida nella posizione corretta del chip e lascia che si incastri. Tieni delicatamente la membrana ferma.
Riapplica la malta PDMS sopra la membrana, allontanandoti dalla camera ad ogni colpo per rimuovere bolle e fissare la membrana senza cambiarne la posizione. Inserire immediatamente le metà del chip a membrana in una camera a vuoto dopo l'applicazione della malta e indurirle a temperatura ambiente sotto un vuoto di 25 millibar per 72 ore. Accendi la pompa a vuoto, il modulatore di pressione e il forno al plasma.
Imposta la pressione della camera a 320 millibar. Poi inserisci sia la parte chip a membrana che la seconda parte chip all'interno per 30 secondi di trattamento al plasma con ossigeno. Dopo aver rimosso i chipoli dalla camera a vuoto, premi rapidamente le due metà insieme con una leggera pressione manuale per completare l'assemblaggio del chip.
La malta PDMS tinta con il rosso del Nilo è stata utilizzata per visualizzare l'intrusione della malta liquida nei pori da 0,4 micrometri delle membrane PET e PC durante la sigillatura sottovuoto a temperatura ambiente. L'imaging al microscopio ha mostrato che il silicone era riuscito a invadere i pori e a ricoprire sottilmente la superficie. Anche impalcature extracellulari contenenti membrana basale si sono legate con successo all'interno del dispositivo del chip, dimostrando l'ampia applicabilità di questa procedura per ottenere un legame forte e flessibile tra diversi tipi di membrane.
Il test di integrità della membrana della matrice extracellulare ha rivelato che la membrana ha resistito a un millimetro di allungamento orizzontale ciclico indotto dal vuoto durante la notte. Per validare le prestazioni del chip come via aerea su chip per la coltura cellulare dell'interfaccia aria-liquido, sono state coltivate cellule epiteliali Calu-3 polmonari umane fino alla confluenza ed esposta all'aria nel dispositivo. Dopo 10 giorni di esposizione all'aria apicale, le cellule si sono differenziate in cellule produttrici di muco, come dimostrato dalla colorazione blu alciana.
Quando le cellule epiteliali sono co-colte con i fibroblasti sulla membrana della matrice extracellulare, le cellule epiteliali formano uno strato monofluente sul lato interno, mentre i fibroblasti sono distribuiti meno densamente sulla superficie esterna e mantengono una morfologia simile a un fuso. Questa procedura facilita la produzione di dispositivi organ-on-chip nella maggior parte degli ambienti vivi. È accessibile sia ai nuovi sviluppatori che ai laboratori a basso reddito.
Le cellule epiteliali possono essere coltivate nel dispositivo all'interfaccia aria-liquido, co-colture con altri tipi cellulari e la loro integrità della barriera è facilmente indagata.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo flusso di lavoro accessibile per sigillare dispositivi Organo-su-Cip in PDMS con membrane porose, consentendo un assemblaggio robusto e privo di perdite adatto a colture all'interfaccia aria-liquido (ALI). Il metodo è stato progettato per facilitare lo sviluppo di chip per nuovi ricercatori e laboratori con risorse limitate, sostenendo applicazioni come modelli di Tratto Respiratorio-su-Cip, Intestino-su-Cip e Pelle-su-Cip.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria biomedica
- Tecnologia organo-su-cip
- Realizzazione di dispositivi per colture cellulari
Sfondo
- Le piattaforme organo-su-cipolla sono sempre più utilizzate per modellare tessuti e malattie umane.
- La sigillatura affidabile e senza perdite dei dispositivi a chip rimane una sfida tecnica importante, specialmente con membrane porose.
- I metodi esistenti spesso richiedono materiali o attrezzature specializzati, limitando l'accessibilità per laboratori nuovi o con risorse limitate.
- È necessario disporre di tecniche di sigillatura semplici e ampiamente applicabili, compatibili con vari tipi di membrane.
Scopo dello studio
- Sviluppare e dimostrare un protocollo di sigillatura robusto e riproducibile per dispositivi in PDMS di tipo Organ-on-Chip che utilizzano membrane porose.
- Consentire la fabbricazione di chip ALI adatti alla coltura cellulare, inclusi modelli di vie aeree, intestino e pelle.
- Verificare la compatibilità del metodo con membrane sia sintetiche (PET, PC) che biologiche (ECM).
Metodi Utilizzati
- Preparazione delle due metà del chip in PDMS mediante stampi in 3D e protocolli standard di polimerizzazione.
- Taglio e sagomatura di membrane porose in PET, PC o matrice ECM mediante stencil.
- Preparazione di una malta in PDMS-toluene, degasata ed applicata sulle superfici del chip e sulle membrane.
- Infiltrazione assistita da vuoto della malta in PDMS nei pori della membrana, seguita da polimerizzazione a temperatura ambiente sotto vuoto per evitare stress termici.
- Trattamento al plasma di ossigeno e assemblaggio manuale delle due metà del chip per la costruzione finale del dispositivo.
- Convalida mediante visualizzazione con colorante rosso Nilo, test meccanici di trazione e saggi di coltura cellulare con cellule epiteliali Calu-3 e fibroblasti.
Risultati principali
- La malta in PDMS ha infiltrato con successo e aderito a pori di 0,4 μm nelle membrane in PET e PC, come visualizzato mediante microscopia.
- Le membrane ECM sono state anch'esse sigillate efficacemente e hanno resistito a cicli di stiramento meccanico per tutta la notte.
- I chip assemblati hanno sostenuto la coltura in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI) di cellule epiteliali Calu-3, che si sono differenziate in cellule produttrici di muco dopo 10 giorni di esposizione all'aria.
- È stata ottenuta una co-coltura con fibroblasti, con localizzazione distinta dei tipi cellulari sulla membrana ECM.
- Il flusso di lavoro è accessibile, economico ed adatto a una vasta gamma di ambienti di laboratorio.
Conclusioni
- Questa procedura di sigillatura consente un'adesione affidabile e flessibile di chip in PDMS a diverse membrane porose.
- Il metodo supporta applicazioni robuste di colture cellulari e co-colture all'interfaccia aria-liquido (ALI) in dispositivi Organo-su-Cip.
- Riduce le barriere tecniche per i nuovi arrivati e per laboratori con risorse limitate nel campo dell'Organo-su-Cip.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La sigillatura affidabile e senza perdite dei dispositivi Organ-on-Chip rappresenta un collo di bottiglia persistente nello sviluppo di modelli traslazionali, influenzando negativamente l'affidabilità predittiva dei sistemi preclinici. Questo protocollo accessibile di sigillatura tra chip in silicone e membrana consente l'assemblaggio robusto di chip in PDMS a camere multiple con diverse membrane porose, supportando colture riproducibili e scalabili all'interfaccia aria-liquido (ALI). Riducendo le barriere tecniche, questo metodo migliora la fase iniziale della scoperta, la modellizzazione delle malattie e la standardizzazione tra laboratori nel settore biofarmaceutico&D portfolio.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la costruzione di modelli Organo-su-Chip fisiologicamente rilevanti per l'analisi mirata degli obiettivi ipotetici.
- Facilita la validazione funzionale dell'integrità della barriera e della differenziazione cellulare in sistemi rilevanti per la patologia.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica consentendo la co-coltura e la modellizzazione dinamica dei tessuti.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una fabbricazione standardizzata e riproducibile di chip per saggi quantitativi basati su cellule.
- Garantisce un'integrazione della membrana senza perdite e robusta, per flussi di lavoro affidabili di screening di composti.
- Consente la preparazione di sistemi ALI per applicazioni di screening ad alto contenuto e scalabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea agli studi traslazionali sui biomarcatori supportando la coltura di cellule umane all'interfaccia aria-liquido.
- Mantiene la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica grazie alla compatibilità con membrane flessibili.
- Riduce il rischio di fallimenti tecnici nella modellizzazione avanzata dei tessuti e nella simulazione delle malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa procedura di sigillatura si integra nel percorso di sviluppo dell'Organ-on-Chip, dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, ogni volta che è richiesta una saldatura robusta della membrana.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi in modelli di tessuti ingegnerizzati.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per saggi sulla funzione di barriera e sul fenotipo cellulare.
- Analisi: Permette la misurazione diretta dell'integrità della membrana e della differenziazione cellulare in condizioni ALI.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento con modelli di tessuti umani pertinenti alle malattie per studi sui biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità di sigillatura ampiamente applicabile e riutilizzabile per diverse progettazioni di chip e tipi di membrana.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli organotipici.
- Valore operativo: Standardizza il montaggio del chip, migliora la riproducibilità e supporta la scalabilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Consente decisioni più accurate di tipo go/no-go e una maggiore efficienza del capitale riducendo il rischio tecnico nello sviluppo del modello.
- Impatto del Portfolio Supporta la priorizzazione e l' avanzamento in base al rischio di modelli traslazionali nella R&D pipeline.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione del PDMS, nella preparazione delle membrane e nell'assemblaggio assistito da vuoto.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture di laboratorio standard: camera a vuoto, pulitore al plasma e cappa aspirante.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per la fabbricazione riproducibile dei chip e l'integrazione delle membrane.
- Adattabile a una varietà di tipi di membrane sintetiche e biologiche, consentendo l'uso di diversi sistemi modello.
- La polimerizzazione a temperatura ambiente riduce i problemi di espansione termica, ma richiede tempi di indurimento più lunghi.
