Name: Luso di Arabidopsis Mutanti eceriferum da esplorare per cuticole Biosintesi impianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-31T22:16:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Esplora la biosintesi della cuticola in Arabidopsis usando mutanti eceriferum. Questo metodo combina genetica diretta e inversa per analizzare la composizione chimica e la struttura dei cristalli di cera.

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I. schermi visivi e Reverse Approcci genetici per identificare Mutanti cuticola. Mutanti cuticola nel modello vegetale Arabidopsis thaliana sono chiamati &quot;eceriferum&quot; mutanti, che significa &quot;cera non cuscinetto&quot;. Possono essere a schermi visivi, cioè, solo guardando il mutante, si può vedere che il gambo infiorescenze di piante wild-type è biancastra, mentre i mutanti hanno steli lucido verde scuro. Uno dei mutanti che è stato isolato in questo tipo di schermo visivo è questo, chiamato eceriferum4 o cer4. Un altro modo di scoprire mutanti cuticola è interessante con un approccio inverso genetica: geni candidati scegliendo di interesse e quindi le linee dell&#39;impianto studiando con quel gene interrotto. Questi mutanti hanno TDNA interrompere il gene di interesse, in questo caso, un citocromo P450 che oggi chiamiamo MAH1. Risultati della PCR (come quello mostrato nel video) in grado di confermare che l&#39;inserimento TDNA è nel gene di interesse. Quando due geni specifici primer sono utilizzati per amplificare DNA wild-type, vediamo un prodotto, ma se il TDNA interrompe, come in questo mutante, non vi è nessun prodotto lì. Al contrario, utilizzando primer specifici per il TDNA e gene, un prodotto è visto solo nel mutante. Siamo alla ricerca di linee omozigoti mutanti, dove sono interrotte sia la copia materna e paterna del gene. Se una copia del gene è interrotto da TDNA e l&#39;altra copia è ancora wild-type, i risultati della PCR sono mescolati. II. Mediante gascromatografia per determinare la composizione chimica della cera Cutlicle. Analizziamo la composizione chimica della cera mediante gascromatografia. In primo luogo, i composti solubili in cera vengono rimossi dalla superficie della pianta per immersione nel cloroformio. Poi, i campioni sono iniettati nella colonna gascromatografica, dove saranno riscaldati e inviati attraverso un flusso di gas. Composti diversi bastone più o meno alle pareti della colonna, che separa i composti, e vengono fuori uno dopo l&#39;altro all&#39;altra estremità della colonna. Poi, come i composti passano sopra il rivelatore a ionizzazione di fiamma, vediamo le cime. Il tempo di ritenzione dei picchi è caratteristico per i composti diversi, dalla spettrometria di massa, abbiamo identificato ciascuno dei componenti di cera Arabidopsis. Le cime più importanti presenti sono quella del C29 alcano, la C29 e la C29 chetone alcol secondario. Le cime minori sono gli alcoli secondari, acidi grassi, aldeidi ed esteri. L&#39;area sotto i picchi, rispetto alla standard, ci dice quanto di ogni composto è presente. Se si guarda alla cromatogrammi gas da questi mutanti cuticola, si può notare come cer4 manca la alcoli primari ed esteri, mentre mah1 manca di alcoli secondari e chetoni. Questi fenotipi possono dirci molto sulla funzione del gene di interesse nella pianta. Per esempio, prima di sapere quale gene è mutato nella linea cer4, il fenotipo ci ha detto che c&#39;era un problema nel settore alcol primario della via biosintetica. Accertata l&#39;identità molecolare di quel gene è stato studiato in laboratorio Kunst, si è scoperto che è parte di una famiglia di geni di riduttasi acil grassi, che si adatta bene con questo fenotipo chimici. III. Utilizzando Cryo-SEM per determinare la struttura dei cristalli Cuticle Quando studiamo la cuticola mutanti di Arabidopsis, possiamo vedere se hanno il verde scuro, lucida o fenotipo wild-type aspetto biancastro sul gambo. Noi usiamo il microscopio elettronico a scansione a guardare la cuticola sulla superficie della pianta e di individuare la base del fenotipo visiva. Noi usiamo crio-SEM, il congelamento delle piante e la visualizzazione a temperatura dell&#39;azoto liquido per mantenere la cuticola intatta perché la SEM richiede un vuoto da utilizzare e senza tenerli congelati, i campioni si asciugano e collasso. Qui cer4 e mah1 campioni, insieme con la wild-type di controllo, vengono sezionati e congelato sulla matrice SEM. Quando i campioni vengono trasferiti al freddo fase del microscopio, si può vedere che la superficie del wild-type cuticola Arabidopsis stelo è ricoperto di cristalli. E &#39;la luce che è scattering quei cristalli che dà il tronco il suo aspetto biancastro. Ecco il gambo cer4; ricordare sembrava lucido? Manca i cristalli sulla superficie. La gente ha fatto esperimenti in cui isolare un composto pura cera dalla cuticola di una pianta e quando lo ricristallizzare in laboratorio, i cristalli di ottenere i profili identici a quelli presenti sulle piante. In Arabidopsis, crediamo che i cristalli sono costituiti da una miscela di composti e la situazione è più complicata. Per esempio, l&#39;analisi chimica ci mostra che in cer4, solo la componente minore di alcoli primari e loro esteri derivati ​​sono mancanti, ma i cristalli del cer4 staminali sono andati. Nel caso di mah1, l&#39;effetto della mutazione in quella degli enzimi del citocromo P450 è che le piante mutanti mancano due componenti principali del, cera alcoli secondari e chetoni, ma i cristalli sulla mah1 piante modulo normalmente. Per saperne di più su mutanti di Arabidopsis cuticola vai alla <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.59.103006.093219" target="_blank">Annual Review di Biologia Vegetale</a> .

l&#39;uso di arabidopsis mutanti eceriferum da esplorare per cuticole biosintesi impianto

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

La cuticola pianta è un rivestimento ceroso esterno sulle piante che ha un ruolo primario nella conservazione dell&#39;acqua, ma è anche un importante barriera contro l&#39;ingresso di microrganismi patogeni. La cuticola è costituita da un polimero duro reticolato chiamato &quot;cutina&quot; e uno strato di cera protettiva che sigilla la superficie della pianta. Lo strato ceroso della cuticola è evidente in molte piante, che appare come una pellicola lucida sulla foglia di edera o come rivestimento polveroso esterno sulla superficie di un chicco d&#39;uva o una foglia di cavolo, grazie alla luce cristalli di scattering presenti nella cera. Perché la cuticola è un adattamento essenziale di piante ad un ambiente terrestre, la comprensione dei geni coinvolti nella formazione vegetale cuticola ha applicazioni in agricoltura e silvicoltura. Oggi, ci mostrano l&#39;analisi dei mutanti cuticola piante identificate da marcia avanti e retromarcia approcci genetica.

La cuticola pianta è un rivestimento ceroso esterno sulle piante che ha un ruolo primario nella conservazione dell&#39;acqua, ma è anche un importante barriera contro l&#39;ingresso di microrganismi patogeni. In questo video, si dimostra l&#39;analisi dei mutanti cuticola piante identificate da marcia avanti e retromarcia approcci genetica.

L&#39;uso di Arabidopsis Mutanti eceriferum da esplorare per cuticole Biosintesi impianto

La cuticola vegetale è un rivestimento esterno ceroso delle piante che svolge un ruolo primario nella conservazione dell'acqua, ma rappresenta anche un'importante barriera contro l'ingresso di...

La cuticola vegetale è un rivestimento esterno ceroso presente sulle piante che ha un ruolo primario nella conservazione dell'acqua, ma costituisce anche una barriera importante contro l'ingresso di microrganismi patogeni. La cuticola è composta da un polimero resistente reticolato chiamato cutina e da uno strato protettivo di cera che sigilla la superficie della pianta. Lo strato ceroso della cuticola è evidente su molte piante, appare come un film lucido sulla foglia di edera o come un rivestimento esterno polveroso sulla superficie di un acino d'uva o di una foglia di cavolo.Grazie ai cristalli che diffondono la luce presenti nella cera, poiché la cuticola rappresenta un'adattamento essenziale delle piante all'ambiente terrestre. Comprendere i geni coinvolti nella formazione della cuticola vegetale ha applicazioni sia in agricoltura che in silvicoltura. Oggi illustreremo l'analisi della cuticola vegetale MUS identificata mediante approcci di genetica diretta e inversa.Ciao, mi chiamo Patricia Lam del laboratorio di Lyrica Kunz presso il Dipartimento di Bot dell'UVC. Oggi, io e gli altri vi mostreremo come queste piante AB do can siano studiate per comprendere come le piante producono una determinata cera. Sono Meen del laboratorio di Brain Heart Jet all'UVC; vi mostrerò come analizziamo la composizione chimica della cera cuticolare mediante cromatografia gassosa.E io sono Alan Dub Bono del laboratorio di Lacey Samuels, anch'esso all'UBC, e vi mostrerò come analizziamo la struttura cristallina sulla superficie dell'opsis utilizzando la microscopia elettronica a scansione criogenica. Il nostro obiettivo generale è comprendere come le piante prendano acidi grassi comuni di 16 o 18 atomi di carbonio, li allunghino fino a catene molto lunghe di 26-34 atomi di carbonio e quindi li modifichino in lipidi protettivi che troviamo sulla superficie della pianta.Quindi cominciamo e vi mostrerò come identifichiamo specifici tipi di cere utilizzando approcci genetici diretti e inversi. Salve di nuovo. Qui abbiamo un mutante Cut di rapid opis, che chiamiamo sro, il che significa privo di cera.Per isolare questi mutanti sono stati utilizzati schermi visivi, il che significa che sono stati identificati a vista. Osservando i mutanti, si può notare che l'influsso e i fusti delle piante di tipo selvatico sono di colore biancastro, mentre i mutanti presentano fusti scuri, verdi e lucenti. Uno dei mutanti isolati mediante questo tipo di schermo visivo, effettuato da Martin K e dai suoi collaboratori, è quello chiamato is from four o SIR four.Un altro modo per identificare mutanti cuco consiste nell'utilizzare un approccio di genetica inversa, selezionando geni candidati e successivamente analizzando linee PLA in cui tali geni risultano interrotti in questi mutanti; per interrompere il gene di interesse è stato utilizzato TDNA. TDNA è un segmento di DNA trasferito che si inserisce nella pianta grazie ad *Agrobacterium tumefaciens* in natura. Questo batterio infetta il DNA come parte del suo processo infettivo, ma gli scienziati hanno reso innocuo il batterio in modo che non sia patogeno, utilizzandolo come strumento per trasferire DNA nelle piante.In questo caso del nostro studio della cuticola, abbiamo utilizzato il TDNA per interrompere il gene che codifica per un enzima citocromo P450, che ora chiamiamo M1. Per confermare che l'inserzione del TDA ha interrotto il gene M1, eseguiamo una PCR. La gel elettroforesi PCR mostrata qui conferma che l'inserzione del TDA si trova nel gene di interesse. Quando due primer specifici per il gene vengono utilizzati per amplificare il DNA di tipo selvatico, osserviamo un prodotto indicato dalla banda in questa corsia, ma il TD lo interrompe come nel mutante.Non si ottiene alcun prodotto utilizzando al contrario un primer specifico per il TDNA e per il gene. Un prodotto è visibile soltanto nel mutante. Di norma, cerchiamo linee mutanti omozigoti in cui siano interrotte sia la copia materna che quella paterna del gene.Tuttavia, quando una copia del gene è interrotta dal TDNA e l'altra copia è ancora di tipo selvaggio, i risultati della PCR R sono misti come in questo caso. Ora che ti ho mostrato come identificare il mutante della cuticola surf four ml one me, ti mostrerò come identificare la composizione chimica utilizzando la cromatografia gassosa. Grazie Patricia.Procediamo ora con l'analisi della cuticola I prima della cromatografia in fase gassosa. I composti di cera solubili devono essere rimossi dalla superficie della pianta immergendola in cloroformio. Il cloroformio rimuove completamente la cera solubile, ma anche il cutina dalla pianta.Dopo aver solubilizzato i componenti della cera, la miscela di cera in cloroformio viene iniettata nella colonna di cromatografia gassosa, dove sarà riscaldata e trasportata da un flusso di gas. I diversi composti della miscela di cera aderiscono in misura maggiore o minore alle pareti della colonna, separandosi tra loro, ed escono uno dopo l'altro all'estremità opposta della colonna. Quando i composti passano attraverso il rivelatore a ionizzazione di fiamma, osserviamo i picchi.Il tempo di ritenzione di ciascun picco è caratteristico per composti diversi e, utilizzando la spettrometria di massa, abbiamo identificato ciascun componente della cera ADOS. Osservando il cromatogramma di una pianta di tipo selvatico, possiamo vedere i picchi principali corrispondenti a un chetone con catena lineare di 29 atomi di carbonio e un alcol secondario.I picchi minori sono gli alcoli primari in altezza, e l'area sotto i picchi rispetto allo standard ci indica la quantità di ciascun composto presente. Ecco i cromatogrammi delle linee vegetali che ci ha appena mostrato Patricia. Osservate come manchi gli alcoli primari e gli esteri, mentre ma uno manchi alcoli secondari e chetoni.Questi fenotipi possono rivelarci molto riguardo alla funzione del gene di interesse nella pianta. Ad esempio, prima di sapere quale gene fosse mutato nella linea pho, il fenotipo ci indicava un problema nel ramo dell'alcol primario del percorso biosintetico. Dopo che l'identità molecolare di quel gene è stata studiata nel laboratorio di consta, si è scoperto che fa parte di una famiglia genica di riduttasi degli acidi grassi, il che è in accordo con questo fenotipo chimico.Ora possiamo posizionare questi geni nel percorso metabolico che mostra come la pianta sintetizza questo componente della cera. Bene, questo è il modo in cui analizziamo la composizione chimica dei nostri mutanti della cuticola. Ora Alan ci mostrerà come esaminiamo la struttura della cuticola utilizzando la microscopia elettronica a scansione. Grazie.Ow. Vuole qualcuno vedere alcune immagini dettagliate della cuticola? Cominciamo. Quando studiamo i mutanti di Rapid opsys sine ad occhio nudo, possiamo osservare che presentano un fenotipo verde scuro e lucente.Quando studiamo piante di tipo selvatico, possiamo osservare un aspetto biancastro sul fusto per determinare la base di questi fenotipi visibili a occhio nudo. Il microscopio elettronico a scansione viene utilizzato per analizzare la struttura del rivestimento superficiale della pianta. Poiché conosciamo la composizione chimica della cera grazie ai risultati della cromatografia gassosa, possiamo osservare come la chimica sia correlata alla struttura dei cristalli di cera.Questi cristalli saranno la prima cosa che un insetto o un patogeno incontreranno atterrando sulla superficie del fusto. Pertanto, rappresentano una componente importante dell'alga cuticolare. Durante l'esecuzione della SEM criogenica, le piante devono essere congelate.In azoto liquido, le piante vengono mantenute tra meno 150 e 100 gradi Celsius durante l'osservazione. Sotto il microscopio, temperature estremamente basse sono essenziali per mantenere intatte le cellule, poiché il microscopio elettronico a scansione richiede un vuoto per funzionare e, in assenza di congelamento, i campioni si seccherebbero e collasserebbero. Ora siamo pronti per dissezionare i campioni di surfer four e mah one insieme ai controlli di tipo selvatico.Ho prima rimosso i fiori e i CLICs da queste piante, quindi ho isolato segmenti di fusto corrispondenti dal punto di vista dello sviluppo da piante di tipo selvatico e da mutanti. Successivamente li ho montati sullo stadio del SEM. Quando i campioni vengono trasferiti sullo stadio freddo del microscopio e osservati, si può notare che la superficie del cuticolo del fusto di tipo selvatico iper avido di opsis è ricoperta di cristalli.La luce proveniente da quei cristalli conferisce al fusto un aspetto biancastro. Ricordate ora come il fusto appariva lucido nei mutanti. Nelle immagini al SEM si può osservare che sulla superficie mancano i cristalli.Allora, da cosa sono composti questi cristalli e cosa conferisce loro forme così particolari? La risposta è diversa. I componenti chimici della cera producono cristalli di forme differenti.In esperimenti in cui un singolo composto puro di cera, isolato dalla cuticola di una pianta, è stato ricristallizzato, i cristalli assumono le stesse forme di quelle presenti sulle piante. Nell'opside del coniglio, riteniamo che i cristalli siano costituiti da una miscela di composti e la situazione sia molto più complessa. Ad esempio, l'analisi chimica effettuata mediante MEO mostra che nel surf quattro manca soltanto il componente secondario di alcoli primari e dei loro esteri derivati.Tuttavia, i cristalli sulle piante con quattro steli sono scomparsi. Nel caso di M1, l'effetto della mutazione nell'enzima citocromo P quattro 50 è che le piante mutate mancano di due componenti principali della cera, alcoli secondari e chetoni. Tuttavia, i cristalli sulle piante MAH uno si formano normalmente.Quindi si osserva l'assenza di cristalli che diffondono la luce, caratteristica dei mutanti SRA. Il loro fenotipo lucido è sempre positivamente correlato a un cambiamento nella composizione del tegumento. Tuttavia, un mutante come mah uno non sarebbe mai stato identificato utilizzando questo approccio, poiché i suoi cristalli sono normali nonostante le alterazioni del fenotipo chimico rivelate dalla cromatografia gassosa.Pertanto, sono necessari anche approcci di genetica inversa per identificare geni della cuticola appartenenti a famiglie geniche note. Abbiamo appena dimostrato che sia la genetica diretta che quella inversa ci permettono di identificare mutanti della cuticola con fenotipo rub dous. L'analisi chimica del fenotipo dei mutanti mediante cromatografia gassosa ci ha aiutato a comprendere come le piante sintetizzino i lipidi protettivi della cuticola. La SEM criogenica ci ha mostrato come i cristalli presenti sulla superficie della pianta cambino quando la composizione chimica della cuticola varia.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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