In vitro Analisi funzionale delle cellule T regolatorie: attenzione alla proliferazione e differenziazione

Il nostro laboratorio ha studiato la differenziazione, il metabolismo e l'interazione dei sottoinsiemi delle cellule T. Il Treg influenza la diafonia delle cellule T, mantiene l'omeostasi immunitaria, rendendo la ricerca sui Treg cruciale per il trattamento delle malattie autoimmuni e infiammatorie. I tradizionali saggi in vitro di soppressione Treg hanno trascurato gli effetti mediati dal Treg e la differenziazione delle cellule T degli effettori.

Questo protocollo modificato valuta simultaneamente sia la proliferazione che la polarizzazione. Per cominciare, preparare cellule T naïf, cellule regolatorie T o arricchite con Treg, e cellule non CD4 positive arricchite per antigeni. Centrifugare la sospensione ingenua di cellule T CD4-positive a 350G per sette minuti a quattro gradi Celsius e scartare il sovrantantante per ottenere la pallina cellulare.

Diluire il colorante di proliferazione cellulare eFluor 450 in PBS per ottenere una concentrazione di 20 micromolari a temperatura ambiente. Aggiungi 0,5 millilitri di PBS per 10 alla potenza di sette celle del tubo. Mantieni il tubo inclinato a circa 45 gradi e risospezioni delicatamente le cellule pipettando su e giù 50 volte.

Successivamente, aggiungere rapidamente un volume uguale di soluzione di colorante di proliferazione cellulare nella sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari. Tieni il tubo a un angolo di 45 gradi e pipetta le cellule per mescolarle accuratamente con il colorante di proliferazione cellulare. Avvolgi immediatamente il tubo della centrifuga con della carta di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.

Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti mentre le vortice delicatamente ogni cinque minuti per prevenire l'aggregazione cellulare. Successivamente, aggiungi 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare pre-raffreddato al tubo della centrifuga e fai un vortice delicato sulle cellule per terminare la colorazione. Poi centrifuga le celle e scarta il soprantantante.

Per lavare le cellule, aggiungi cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare pre-raffreddato al pellet cellulare. Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura. Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare le cellule e risospendere in un volume appropriato di mezzo di coltura per raggiungere una concentrazione cellulare di due volte 10 alla potenza di sei celle per millilitro.

Tieni il tubo sul ghiaccio. Calcola il numero di campioni necessari per la coltura cellulare. Prepara una quantità adeguata di mezzo di coltura cellulare contenente 2,5 microgrammi per millilitro di anticorpo anti-topo CD3 o le citochine di induzione appropriate.

Prendi cellule T ingenue preparate e cellule arricchite con Treg e vorticale. Aggiungi 100 microlitri di cellule T naïve positive CD45.2 positive e CD4 positive e 100 microlitri di cellule non CD4 positive ad APC positive CD45.1 alla piastra a 48 pozzi. Trasferire 100 microlitri di cellule arricchite con Treg CD45.1 positive, CD4 positive e CD25 positive nei pozzi sperimentali e 100 microlitri di mezzo di coltura cellulare nei pozzi di controllo.

Successivamente si pipettano 100 microlitri di mezzo di coltura contenente anticorpi anti-topo CD3 e 100 microlitri di mezzo di coltura contenenti le citochine di induzione appropriate in ciascun pozzo. Aggiungi PBS ai pozzi vuoti rimanenti per mantenere l'umidità della piastra e ridurre gli effetti di bordo. Incubare la piastra da 48 pozzi in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per tre giorni.

Pipetta delicatamente le cellule coltivate per risospenderle e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifuga le celle e rimuovi il soprantantante. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura cellulare contenente phorbol 12-miristato 13-acetato, ionomicina e inibitore del trasporto proteico GolgiPlug a ciascun tubo.

Vortice delicato per risospendere le cellule e incubarle in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo la centrifugazione, aggiungere 50 microlitri di PBS contenente un test di colorante giallo zombie e anticorpi anti-topo diluiti 1:100 CD16 o 32 alla pellet. Vortice i campioni e incuba a temperatura ambiente al buio per 15 minuti per etichettare le cellule morte e bloccare i recettori FC.

Centrifuga le celle prima di scartare il soprantantante. Aggiungi 50 microlitri di cocktail di anticorpi superficiali al campione, vortiscalo e incuba a quattro gradi Celsius al buio per 20 minuti. Poi aggiungi un millilitro di tampone per cellule attivate a fluorescenza o FACS a ciascun tubo centrifuga.

Dopo centrifugazione e rimozione del soprandante, aggiungere 300 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione a ciascun tubo centrifuga e vorticare i campioni. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius al buio per 20 minuti. Trasferire un millilitro di permeabilizzazione e il tampone di lavaggio a ciascun tubo della centrifuga, seguiti da centrifugazione e rimozione del sovrantante.

Dopo aver ripetuto il lavaggio, aggiungi 50 microlitri di cocktail di anticorpi di citochine a ciascun campione e trasforma i campioni in vortice. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius al buio per 40 minuti. Lavare ogni campione con un millilitro di permeabilizzazione e lavaggio tampone.

Centrifuga le celle e rimuovi il soprantantante. Risospendere il pellet cellulare in 300 microlitri di buffer FACS. Misurare la proliferazione e la differenziazione delle cellule T rispondenti tramite citometria a flusso.

Blocca la popolazione di linfociti tra le cellule totali per escludere detriti cellulari e impurità. Seleziona la popolazione cellulare singola tra i linfociti in base ai segnali di scatter. Successivamente identifica la popolazione di cellule vive tra le singole cellule, seguita dalla popolazione di cellule T CD4 positive tra le cellule vive.

Successivamente, si porta la popolazione arricchita di cellule T regolatorie positive a CD45.1 e la popolazione di cellule T effettori positivi a CD45.2 tra le cellule T positive a CD4. Successivamente seleziona le cellule T helper gamma positive a interferone positivo CD4.2 positivo CD45.2, le cellule helper T positive CD45.2 positive CD4 positive a CD4 17 e le cellule T CD4 positive non proliferate CD45.2 positive tra le cellule T positive CD45.2 positive. Effettuare l'acquisizione dei dati della citometria a flusso per tutti i campioni.

Infine, analizzare i dati della citometria di flusso con il software FlowJo utilizzando la stessa strategia di gating dell'acquisizione dati della citometria a flusso. La frequenza delle cellule T rispondenti non proliferate è stata significativamente aumentata sia nelle condizioni di induzione di T helper 1 che di T helper 17 dopo la co-coltura con cellule regolatorie arricchite da cellule T. La differenziazione delle cellule T helper 1 positive a CD45.2, interferone gamma positivo a CD4 è stata significativamente soppressa dopo la co-coltura con cellule regolatorie arricchite con cellule T.

La frequenza di 17 cellule T helper positive a CD45.2 e CD4 positive interleucina-17A a T helper 17 è aumentata quando le cellule T rispondenti sono state colte con cellule regolatorie arricchite da cellule T. L'analisi funzionale in vitro delle cellule Treg consente di indagare gli effetti biodirezionali tra cellule Treg ed T effettrici sulla proliferazione e polarizzazione. La sfida più grande nell'esecuzione di questo protocollo è come mantenere la vitalità delle cellule garantendo la purezza delle cellule Treg e delle cellule T naïf.

A seguito di questo processo, ELISA e altri saghi biomedici possono valutare la produzione di citochine ed effettori metabolici, mentre le cellule FACS selezionate permettono analisi a valle di RNA-seq e proteomica.