Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Ciao, sono Amish Matan e lavoro nel laboratorio del dottor Sha Mc Barian presso il dipartimento di psichiatria della UMass Medical School. Oggi vi mostrerò un procedimento per l'immunoprecipitazione della cromatina su tessuto cerebrale umano post mortem. Anche se il seguente procedimento non è particolarmente complesso.

Quello che è più entusiasmante è che fino a poco tempo fa gli studi sull'espressione nel cervello umano erano limitati a una semplice quantificazione di mRNA e proteine. Questa particolare tecnica ci fornirà una comprensione migliore della base meccanicistica dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. Cominciamo dunque a immunoprecipitare la cromatina.

Abbiamo iniziato con tessuto cerebrale umano post mortem precedentemente dissezionato e congelato. È importante utilizzare occhiali di sicurezza e lavorare in un'area designata per la manipolazione di tessuto umano. Durante l'elaborazione di questi campioni, il tessuto cerebrale viene trattato con un volume di buffer per down sink pari a cinque volte il volume del cervello.

Una volta che tutti i tessuti sembrano essere diventati omogenei all'interno della soluzione, possiamo trasferirli in una provetta da due ml dopo che il tessuto è stato omogeneizzato. Aggiungere cinque unità per ml di micrococca nuclease al campione e mescolare la soluzione aspirando e dispensando con una pipetta. Successivamente, porre la provetta sul ghiaccio.

È importante eseguire rapidamente questo passaggio, poiché la micrococcale nuclease è in grado di agire anche a quattro gradi Celsius. Una volta che tutti i campioni sono stati trattati con micrococcale nuclease, passiamo rapidamente al bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubiamo i campioni per sette minuti.

Dopo l'incubazione di sette minuti, aggiungiamo EDTA 0,5 M a una concentrazione di 10 millimoli per arrestare l'attività della micrococcale nuclease. A questo punto siamo pronti per passare alla fase di izzazione. Dopo il trattamento con micrococcale nuclease, i nostri campioni, che contengono il DNA nucleosomiale, inizieranno la izzazione.

Nava prenderà un tubo Falcon da 15 ml a cui aggiungeremo 4,5 ml di EDTA 0,2 millimolare, 2,5 microlitri di benadina 0,2 molare e 4,5 microlitri di PMSF 0,1 molare in questo tubo. Trasferiremo il nostro campione. Ora incubiamo il campione per un'ora sul ghiaccio, vorticosandolo ogni 10 minuti.

Al termine dell'incubazione di un'ora, aggiungeremo 2,5 microlitri di DTT tre molare. Il campione viene vortexato nuovamente, quindi centrifugato in un rotore a pendolo a 3.175 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, il soprannatante viene distribuito in modo che 500 microlitri siano utilizzati come controllo di input, che conterrà esclusivamente DNA genomico, mentre il resto viene suddiviso in due provette contenenti ciascuna 1.600 microlitri di campione, che costituiranno i nostri campioni per l'immunoprecipitazione della cromatina.

Il controllo di input viene posto a meno 80 gradi Celsius durante la notte fino a ulteriore utilizzo. Successivamente, aggiungiamo 160 microlitri di 10 XFSB, pari a un decimo del volume del nostro campione. Insieme a questo, aggiungiamo quattro microgrammi dell'anticorpo.

Ora vortexare i campioni, quindi ruotarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, eseguiremo il lavaggio dei giros proteici che verranno utilizzati per isolare il nostro DNA nucleosomiale. Poiché queste perle di agarosio sono molto sensibili, è necessario tagliare le estremità dei puntali della pipetta quando si lavora con esse.

Questo garantisce che le perle abbiano più spazio durante la pipettaggio. Aggiungere ora 1,6 mil di una perla XFS a 245 microlitri di proteina jaguars in un tubo da centrifuga micro da due mil. Questa quantità dovrebbe essere sufficiente per quattro tubi di campione.

Successivamente, dividere la soluzione di perle in due provette da due mil e riempire ciascuna fino a 1,6 mil con XFSB 1X. Ruotare le provette a temperatura ambiente per 30 secondi su un agitatore rotante, quindi centrifugarle a 0,1 RCF per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, rimuovere l'ATE utilizzando un vuoto.

Aggiungere 1,6 mils di un XFSB. Ruotare nuovamente i campioni per 30 secondi su un agitatore rotante e quindi centrifugarli di nuovo a 0,1 RCF FS per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, rimuoviamo nuovamente il soprannatante e combiniamo entrambe le provette con 1,5 mils di un XFSB.

Aggiungere anche 15 microlitri di DNA spermatico. Ruotare ora a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi centrifugare a 0,1 RCF per 30 secondi. Rimuovere il soprannatante e aggiungere 200 microlitri di FBS 1X.

Ora aggiungere 90 microlitri di agro speeds in ogni campione di precipitazione della cromatina, quindi ruotarli a quattro gradi per un'ora. Come controllo negativo, aggiungere un mil di 1 XFSB negli agro speeds rimanenti e ruotare insieme al campione di immunoprecipitazione della cromatina a quattro gradi Celsius per un'ora. Durante l'incubazione di un'ora, possiamo approfittarne per preparare un po' di buffer di risoluzione fresco.

Questo verrà utilizzato successivamente nell'esperimento dopo l'incubazione di un'ora. Centrifugare i campioni e il controllo negativo a 0,1 CFS per 30 secondi e scartare il soprannatante. Successivamente, si procederà al lavaggio delle perle con quattro diversi tipi di soluzioni di lavaggio: un tampone di lavaggio a bassa forza ionica, un tampone di lavaggio ad alta forza ionica, una soluzione di cloruro di litio e, infine, tampone TE a pH 8.

Per ogni tampone, ad eccezione della soluzione di cloruro di litio, ruoteremo i campioni per tre minuti a temperatura ambiente e quindi li centrifugheremo a 0,1 R Cs per 30 secondi. Per il lavaggio con cloruro di litio, ruotare i campioni a temperatura ambiente per un solo minuto. Dopo ogni lavaggio, eliminare il soprannatante utilizzando un vuoto.

Ora siamo pronti per passare all'eluzione dei nostri campioni. Per iniziare la fase di eluzione, aggiungiamo 250 microlitri di tampone eluente appena preparato a ciascun campione. Ruotare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 0,4 RCF per un minuto.

Ora conservare il soprannatante in un tubo arancione da due ml. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di buffer di eluizione a ciascun campione. Ancora una volta, vortexare manualmente tutti per alcuni secondi.

Quindi vortexare i campioni per 15 minuti dopo averli vortexati per 15 minuti, quindi centrifugare i tubi. Aggiungere 16 RCF per quattro minuti e conservare il sopranatante nello stesso tubo da due millilitri. Per digerire le proteine nei nostri campioni, aggiungere prima 10 microlitri di A DTA 0,5 molar, 25 microlitri di twist HCL L 0,8 molar a un pH di 6,5 e 2,5 microlitri di proteinasi K 10 milligrammi per millilitro a ciascun campione di immunoprecipitazione della cromatina.

Accanto a ogni controllo di input aggiungere 15 microlitri di buffer di lisi e 2,5 microlitri di proteasi K a 10 milligrammi per ml. Incubare sia i campioni di input che quelli di immunoprecipitazione della cromatina a 52 gradi Celsius per almeno tre ore. Ora che l'incubazione di tre ore è terminata, possiamo procedere e iniziare l'estrazione con fenil cloroformio.

Dopo l'incubazione di tre ore, aggiungiamo 500 microlitri di fenil cloroformio a ciascun campione. Questa operazione viene eseguita nella cappa, poiché il fenil cloroformio è una sostanza chimica organica dannosa sia a contatto con la pelle sia se inalata. Successivamente, vortexiamo tutti i campioni per alcuni secondi e li centrifughiamo a 13 RCF per cinque minuti dopo la centrifugazione.

Dovrebbero essere presenti due fasi all'interno dei tubi. Poiché siamo interessati al contenuto della fase superiore, preleveremo questa fase e la trasferiremo in un microcentrifugo da due mil. Successivamente, a ciascun campione viene aggiunta una miscela composta da due microlitri di glicogeno e 50 microlitri di acetato di sodio tre molar, insieme a 1,375 mil di etanolo al cento per cento.

Tutti i campioni vengono vortexati vigorosamente e posti a -80 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, i campioni vengono posti sul ghiaccio per scongelarli. Successivamente, vengono centrifugati ad alta velocità a 15 RCF per 10 minuti a 4 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet sul fondo della provetta. Successivamente, aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 75% a ciascun campione e capovolgere le provette da quattro a sei volte. Le provette vengono quindi centrifugate nuovamente a 18 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Il soprannatante viene nuovamente rimosso e i pellet vengono lasciati asciugare all'aria. Una volta che i pellet sono asciutti, vengono disciolti in 50 microlitri di HCl traccia 4 millimolare a pH 8 e conservati a -80 gradi Celsius fino all'ulteriore utilizzo. Bene, vi ho appena mostrato come eseguire immunoprecipitazioni della cromatina su tessuto cerebrale post mortem umano congelato.

E ricordate, quando si esegue questa procedura, è importante adottare tutte le precauzioni necessarie quando si manipolano tessuti cerebrali umani; i saggi di immunoprecipitazione della cromatina possono essere utilizzati per aggiungere un ulteriore livello di comprensione dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.