Name: Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) su tessuto cerebrale umano post-mortem per studiare la metilazione degli istoni e i meccanismi epigenetici della regolazione genica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Procedimento: 1 ° Giorno 1. Omogeneizzare 50-500 mg di surgelati post-mortem del tessuto grigio questione con Douncing tampone. ! ATTENZIONE - tessuti umani devono essere maneggiati con cura in condizioni di sicurezza rigorose. Pertanto deve essere trattato a BSL-2 o superiore standard di sicurezza. <ol><li> Prendere in precedenza sezionato, post-mortem del cervello da -80 ° C, li dounce del volume cerebrale di tampone 5X Douncing, e il luogo in tubo di 2,0 ml microcentrifuga. Abbinato campione e le coppie di controllo vengono elaborati contemporaneamente. </li></ol> 2. Micrococcal nucleasi (MN) digestione <ol><li> Aggiungi 5U/mL di Micrococcal nucleasi al campione e mescolare all&#39;interno della soluzione pipettando su e giù prima dell&#39;immissione sul ghiaccio. * FASE CRITICA - E &#39;importante fare questo passo in fretta dato che MN ha la capacità di agire anche a 4 ° C. </li><li> Incubare i campioni per 7 minuti a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 7 minuti, aggiungere 0.5M EDTA a una concentrazione di 10 mM per interrompere l&#39;attività MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> I campioni in una provetta da 15 ml falco. Aggiungere 10 volte il volume del campione di 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 volume del campione di benzamidine 0,2 M e il volume del campione 1 / 1000 di phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). Gli ultimi due composti sono usati come inibitori della proteasi. * FASE CRITICA - E &#39;importante mantenere i campioni su ghiaccio per tutti questi passaggi. </li><li> Incubare campione per 1 ora, mentre vortex ogni 10 minuti. </li><li> Al termine della incubazione un&#39;ora, aggiungere il volume del campione 1 / 2000 della 3M DTT, un altro inibitore della proteasi. </li><li> Campione vortice ancora una volta e centrifugare a 3175 RCF per 10 minuti a 4 ° C. * STEP OPTIONAL - Precleansing con proteine ​​G agarosio. <ol><li> Prendere surnatante e mettere in tubo di nuovo 15 ml falco. </li><li> Aggiungere 500 ml di proteina G agarosio. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare a 4000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol></li><li> Distribuire in modo che surnatante 500 microlitri sono utilizzati come controllo di ingresso (che contiene solo DNA genomico), e il resto è diviso in due provette contenenti 1600 ml di ciascun campione - che sono per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) campioni. </li><li> Il controllo d&#39;ingresso è posto a -80 ° CO / N fino a quando un ulteriore uso. </li><li> Per i campioni di ChIP - aggiungere volume 1:10 di 10XFSB e 4μg di anticorpi, poi vortice i campioni e farli ruotare a 4 ° C per una notte. ! ATTENZIONE - Importo e la diluizione di anticorpi può richiedere di ottimizzazione. </li></ol> 2 ° Giorno ! ATTENZIONE! - Inizio 2 ° giorno dal lavaggio delle proteine ​​G agarosio che verrà utilizzato per isolare il DNA nucleosomal. Dal perline agarosio sono molto sensibili, è necessario tagliare la testa delle punte quando pipettaggio qualsiasi soluzione contenente microsfere di agarosio. 1. Probing proteina G Beads agarosio al DNA <ol><li> Aggiungere 1,6 mL 1XFSB a 245 microlitri proteina G-agarosio (sufficiente per 4 tubi) in una provetta 2 mL (anello). </li><li> Separare la soluzione in due 2 mL e ogni ricarica fino a 1,6 ml con 1X FSB. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 secondi e centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Eliminare il surnatante con un aspirapolvere. </li><li> Aggiungere 1,6 ml 1X FSB ancora una volta. Ruotare i campioni per 30 secondi, quindi si centrifuga a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante ancora una volta, e combinare entrambi i tubi con 1,5 ml 1XFSB. </li><li> Aggiungere 15 microlitri sonicato DNA dello sperma di salmone (10mg/ml). ! ATTENZIONE - Questo passo dovrebbe, in linea di principio, ridurre il legame non specifico del immunoprecipitato ai talloni. Tuttavia, questo potrebbe anche portare a falsi positivi per alcune delle (umano) sequenze di DNA. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti, poi centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 ml di 1XFSB. </li><li> Aggiungere 90 ml di perline agarosio in ogni campione ChIP. Ruota a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1XFSB nelle restanti perline agarosio per servire come controllo negativo e ruotare a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo le ore di incubazione lungo, centrifugare i campioni e di controllo negativo a 0,1 RCF per 30 sec. Scartare il surnatante. </li></ol> 2. Lavaggio delle Perle ! ATTENZIONE! - Buffer di lavaggio deve essere conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, e devono essere utilizzate solo se sono meno di un mese. <ol><li> Aggiungere 1 ml di ogni soluzione di lavaggio ai talloni, ruotare per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Gettare il surnatante tramite aspirazione. </li></ol> Ogni soluzione di lavaggio * - Basso sale tampone di lavaggio - Alta sale tampone di lavaggio </p&gt; - Soluzione di cloruro di litio - solo ruotare a temperatura ambiente per 1 minuto! - Tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Eluizione * FASE CRITICA - Fai Buffer fresca eluizione per ogni esperimento il giorno in cui deve essere utilizzato. <ol><li> Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione appena preparati a ogni campione. </li><li> Ruotare per 15 minuti a RT, poi centrifugare a 0,4 RCF per 1 min. </li><li> Salvare il surnatante in una provetta da microcentrifuga 2,0 ml (Loop). </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione per ogni campione e vortice a mano per pochi secondi. Poi, i campioni vortex per 15 minuti su un mulitvortexer. </li><li> Centrifugare a 16 RCF rpm per 4 minuti e salvare surnatante nello stesso tubo di 2,0 mL (Loop). </li></ol> 4. Digerire proteine <ol><li> Aggiungere 10 microlitri EDTA 0.5M, 25 microlitri 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml di proteinasi K (1 / 200 del campione) per ogni campione ChIP. </li><li> Per ogni controllo in ingresso, aggiungere tampone di lisi per la digestione proteinasi K (1 / 10 di tampone campione) e 10mg/ml proteinasi K (1 / 200 di tampone del campione). </li><li> Incubare di ingresso e di campioni di chip a 52 ° C per almeno 3 ore. </li></ol> 5. Fenolo / cloroformio estrazione ! ATTENZIONE - Esperimento che richiedono fenolo / cloroformio deve essere effettuata sotto il cofano. Usare guanti di nitrile quando si maneggia fenolo / cloroformio. <ol><li> Dopo l&#39;incubazione 3 ore, si aggiunge il 500 microlitri fenolo-cloroformio per ogni campione. </li><li> Vortex tutti i campioni per alcuni secondi, poi centrifugare a 13 giri RCF per 5 min. </li><li> A questo punto, due fasi sarà presente e ci interessa il contenuto della fase superiore. Estrarre la fase superiore e metterla in una provetta 2 mL. </li><li> Aggiungere una miscela di 2μL di glicogeno e 50μL di acetato di sodio 3M per ogni campione con 1,375 ml di etanolo al 100%. </li><li> Vortex tutti i campioni vigorosamente. Metterli in -80 ° C durante la notte. </li></ol> 3 ° giorno <ol><li> Rimuovere campioni forma -80 ° C e metterli in ghiaccio per loro di disgelo. </li><li> Centrifugare a 15 RCF per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con cura sopranatante senza far muovere il sedimento sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 75% per ogni campione, poi capovolgere 4-6 volte. </li><li> Centrifugare a 18 RCF per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante una volta di più e consentire il pellet di aria secca. </li><li> Sciogliere pellet essiccato in 50 ml di 4mm Tris-HCl, pH8 e conservare a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

Il protocollo qui descritto è particolarmente utile per i ricercatori interessati ad firme metilazione dell&#39;istone e / o il DNA del cervello umano, perché questi segni cromatina può essere meno soggetti a post-mortem artefatti rispetto ad altri tipi di modifiche, tra cui (gli istoni) acetilazione e fosforilazione 1, 2. Il cervello post-mortem è riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparati; il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core, almeno negli esemplari con intervalli autolisi rappresentante (il tempo t...

Soluzioni: <ul><li> Buffer nChIP Douncing: 10 mM Tris, 4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 aggiustare il pH a 7,5 </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl aggiustare il pH a 7,5 </li><li> Sale di lavaggio tampone bassa: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Buffer sale di lavaggio ad alta: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl </li><li> Tampone al litio cloruro: 1% IGEPAL-CA 630, 1% acido desossicolico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl </li><li> TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Eluizione Buffer: 0,1 M NaHCO 3, 1% SDS </li><li> Proteinasi K buffer di digestione (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl regolare il pH a 8,0 </li><li> 3 M di acetato di sodio: 24,61 g di acetato di sodio anidro (PM = 82,03) in 100 ml di acqua distillata in autoclave. Regolare il pH a 5,2 con acido acetico concentrato. </li></ul>

un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Croniche malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, malattia bipolare e l&#39;autismo si pensa che il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali che potrebbero risultare in alterazioni epigenetiche dell&#39;espressione genica e di altre patologia molecolare. Tradizionalmente, tuttavia, studi di espressione nel cervello post-mortem erano limitati alla quantificazione di mRNA o proteine. I limiti riscontrati nella ricerca sul cervello post-mortem come variabilità nel tempo e integrities autolisi dei tessuti sono anche suscettibili di influenzare tutti gli studi di strutture di ordine superiore della cromatina. Tuttavia, l&#39;organizzazione nucleosomal di DNA genomico tra cui DNA: istone nucleo vincolante - sembra essere in gran parte conservati in campioni rappresentativi forniti dalle banche del cervello diverse. Pertanto, è possibile studiare il modello di metilazione ed altre modifiche covalenti istoni del nucleo a definire loci genomici nel cervello post-mortem. Qui vi presentiamo una versione semplificata nativo immunoprecipitazione della cromatina (NChIP) protocollo per surgelati (mai-fisso) campioni del cervello umano. A partire dalla digestione micrococcal nucleasi omogenati di cervello, NChIP seguita da qPCR può essere completata entro tre giorni. La metodologia qui presentata dovrebbe essere utile a chiarire i meccanismi epigenetici dell&#39;espressione genica in condizioni normali e malate del cervello umano.

Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell&#39;istone e gli altri regolatori epigenetici dell&#39;espressione genica nel cervello post-mortem.

Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Si ritiene che le malattie neuropsichiatriche croniche, quali la schizofrenia, il disturbo bipolare e l'autismo, siano il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali...

Ciao, sono Amish Matan e lavoro nel laboratorio della dottoressa Sha Mc Barian, presso il dipartimento di psichiatria della UMass Medical School. Oggi vi mostrerò un procedimento per l'immunoprecipitazione della cromatina su tessuto cerebrale umano post mortem. Anche se il seguente procedimento non è particolarmente complesso.Quello che è più entusiasmante è che fino a poco tempo fa gli studi sull'espressione nel cervello umano erano limitati a una semplice quantificazione di mRNA e proteine. Questa particolare tecnica ci fornirà una comprensione migliore della base meccanicistica dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. Cominciamo dunque a immunoprecipitare la cromatina.Abbiamo iniziato con tessuto cerebrale umano post mortem precedentemente dissezionato e congelato. È importante utilizzare occhiali di sicurezza e lavorare in un'area designata per la manipolazione di tessuti umani. Durante l'elaborazione di questi campioni, il tessuto cerebrale viene trattato con un volume di buffer per down sink pari a cinque volte il volume del cervello.Una volta che tutti i tessuti sembrano essersi omogeneizzati nella soluzione, possiamo trasferirli in una pr

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L'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Questo protocollo descrive come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è usato per studiare le alterazioni dinamiche al modello cromatina che regolano la trascrizione indotto da una via di trasduzione del segnale.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

Fonte: Mendez, F. M. et al., Immunoprecipitazione della cromatina nativa utilizzando neurosfere tumorali cerebrali mure. J. Vis. Exp. (2018). Questo video dimostra l'isolamento di complessi proteina-DNA da cellule della neurosfera derivate da un tumore cerebrale di topo utilizzando l'immunoprecipitazione nativa della cromatina. Descrive in dettaglio le fasi per la preparazione della cromatina, l'immunoprecipitazione, il lavaggio e la digestione delle proteine per rilasciare il DNA per l'analisi...

Immunoprecipitazione nativa della cromatina delle cellule della neurosfera

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Qui descriviamo un metodo immunochimico sensibile per mappare la distribuzione spaziale dei derivati di ossidazione 5mC basati sull'uso di anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sull'amplificazione del segnale della tiramide.

Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Meccanismi epigenetici sono frequentemente alterati nei gliomi. Immunoprecipitazione della cromatina poteva essere utilizzati per studiare le conseguenze delle alterazioni genetiche in glioma risultanti dalle modifiche in modificazioni istoniche che regolano la trascrizione di gene e la struttura della cromatina. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.

Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Scopri la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) su tessuto cerebrale umano post-mortem per studiare la metilazione degli istoni e i meccanismi epigenetici della regolazione genica.

Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

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