Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Ciao, sono Amish Matan e vengo dal laboratorio del Dr.Sha Mc Barian qui nel dipartimento di psichiatria della UMass Medical School. Oggi vi mostrerò una procedura per l'immunoprecipitazione della cromatina nel tessuto cerebrale umano post mortem. Anche se la seguente procedura non è molto complicata.

La cosa più interessante è che fino a poco tempo fa gli studi sull'espressione nel cervello umano erano limitati alla semplice quantificazione di mRNA e proteine. Questa particolare tecnica ci darà una migliore comprensione delle basi meccanicistiche dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. Quindi iniziamo a far precipitare la cromatina.

Abbiamo iniziato con tessuto cerebrale umano congelato precedentemente sezionato su tessuto cerebrale post-mortem congelato. È importante utilizzare occhiali di sicurezza e lavorare in un'area designata per la gestione dei tessuti umani. Durante l'elaborazione di questi campioni, il tessuto cerebrale viene abbassato con un volume cerebrale cinque volte superiore al tampone di lavandino.

Una volta che tutto il tessuto sembra essere diventato omogeneo all'interno della soluzione, possiamo trasferirlo in una provetta da due mil dopo che il tessuto è stato omogeneizzato. Aggiungere cinque unità per mil di micro nucleasi cocalina al campione e mescolare la soluzione pipettando su e giù. Quindi metterlo sul ghiaccio.

È importante fare il passaggio rapidamente. Poiché la nucleasi del micro-cocco ha la capacità di agire anche a quattro gradi Celsius. Una volta che tutti i campioni sono stati trattati con la micro nucleasi coca, passiamo rapidamente al bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubiamo i campioni per sette minuti.

Dopo l'incubazione di sette minuti, aggiungiamo 0,5 molari di EDTA a una concentrazione di 10 millimoli per fermare l'attività della micro nucleasi del coca. Quindi ora siamo pronti per passare alla fase di izzazione. Dopo aver trattato la nucleasi micrococalica, i nostri campioni che contengono il nostro DNA nucleosomico inizieranno la digestione.

Nava prenderà un tubo Falcon da 15 mil in cui aggiungeremo 4,5 mil di EDTA 0,2 millimolari, 2,5 microlitri di benadina molare e 4,5 micros di PMSF molare in questo tubo. Trasferiremo il nostro campione. Ora incubiamo il nostro campione per un'ora sul ghiaccio, facendolo vorticare ogni 10 minuti.

Al termine dell'incubazione di un'ora, aggiungeremo 2,5 microlitri di DTT a tre molari. Il campione viene nuovamente agitato, quindi viene centrifugato in un rotore a secchiello oscillante a 3, 175 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, il surnatante viene distribuito, in modo che vengano utilizzati 500 microlitri come controllo di input, che conterrebbero solo DNA genomico, e il resto viene diviso in due provette contenenti 1.600 microlitri di campione ciascuna, che saranno i nostri campioni di immunoprecipitazione della cromatina.

Il controllo dell'ingresso viene posizionato a meno 80 gradi Celsius durante la notte fino a un nuovo utilizzo. Successivamente, aggiungiamo 160 microlitri di 10 XFSB un decimo del volume del nostro campione. Insieme ad esso, aggiungiamo quattro microgrammi di anticorpo.

Ora agita i campioni, quindi ruotali a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, laveremo le proteine giros che verranno utilizzate per isolare il nostro DNA nucleosomico. Poiché queste perle agro sono molto sensibili, è necessario tagliare le teste dei puntali delle pipette quando si lavora con esse.

Questo per garantire che le perle abbiano più spazio durante il pipettaggio. Ora aggiungi 1,6 mil di una perlina XFS a 245 microlitri di giaguari proteici in una provetta da microcentrifuga da due mil. Questo dovrebbe essere sufficiente per quattro provette di campione.

Quindi, separare la soluzione di perline in due provette da due mil e riempire ciascuna fino a 1,6 mil con un XFSB. Ruotare le provette a temperatura ambiente per 30 secondi su un rotatore e poi centrifugarle a 0,1 RCF per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, rimuovere l'ATE con l'aiuto del vuoto.

Aggiungi 1,6 mil di un XFSB. Ancora una volta, ruotare i campioni per 30 secondi su un rotatore e poi centrifugarli nuovamente a 0,1 RCF FS per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, rimuoviamo nuovamente il surnatante e combiniamo entrambe le provette con 1,5 mil di un XFSB.

Aggiungi anche 15 microlitri di DNA spermatico. Ora ruotare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi centrifugare a 0,1 RCF per 30 secondi. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 microlitri di un XFSB.

Ora aggiungi 90 microlitri di velocità agro in ogni campione di precipitazione della cromatina, quindi ruotali di quattro gradi per un'ora. Per un controllo negativo, aggiungere un mil di un XFSB alle restanti velocità acro e ruotarlo insieme al campione di immunoprecipitazione della cromatina a quattro gradi Celsius per un'ora. Durante l'incubazione di un'ora, possiamo cogliere l'occasione per creare un nuovo buffer di risoluzione.

Questo verrà utilizzato più avanti nell'esperimento dopo l'ora. Il centro di incubazione presenta i campioni e il controllo negativo a 0,1 CFS per 30 secondi e scarta il surnatante. Successivamente, laveremo le perle con quattro diversi tipi di soluzioni di lavaggio, un tampone di lavaggio a basso contenuto di sale, un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, una soluzione di cloruro di litio e, infine, un tampone TE a pH otto.

Per ogni tampone, ad eccezione della soluzione di cloruro di litio, ruoteremo i campioni per tre minuti a temperatura ambiente e poi li centrifugheremo a 0,1 R Cs per 30 secondi. Per il lavaggio con cloruro di litio, ruotare i campioni a temperatura ambiente per un solo minuto. Dopo ogni lavaggio, scartare il supinato e utilizzando l'aspirapolvere.

Ora siamo pronti per procedere con l'eluizione dei nostri campioni. Per iniziare la fase di eluizione, aggiungiamo 250 microlitri di tampone elu appena preparato a ciascun campione. Ruotare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi centum a 0,4 RCF per un minuto.

Ora conservate il surnatante in un tubo di orango da due mil. Quindi aggiungere 250 microlitri di tampone evolutivo a ciascun campione. Ancora una volta, vorticateli tutti a mano per alcuni secondi.

Quindi agitare i campioni per 15 minuti dopo aver agitato per 15 minuti, far girare le provette nella centrifuga. Aggiungere 16 RCF per quattro minuti e conservare il rullo nello stesso tubo di oring a due mulini. Per digerire la proteina nei nostri campioni, aggiungere prima 10 microlitri di 0,5 molari A DTA, 25 microlitri di 0,8 molari di HCL L a un pH di 6,5 e 2,5 microlitri di 10 milligrammi per milliproteinasi K a ciascun campione di immunoprecipitazione della cromatina.

Accanto a ciascun controllo di ingresso, aggiungere 15 microlitri di tampone di lisi e 2,5 microlitri da 10 milligrammi per ml. La proteinasi K incuba sia i campioni di input che quelli di immunoprecipitazione della cromatina a 52 gradi Celsius per almeno tre ore. Ora che l'incubazione di tre ore è terminata, possiamo continuare e iniziare l'estrazione del fenil cloro Fromm.

Dopo l'incubazione di tre ore, aggiungiamo 500 microlitri di fenil clorofromm a ciascun campione. Questo viene fatto nel cappuccio a causa del fatto che il fenil cloroformio è una sostanza chimica organica che è dannosa sia se viene a contatto con la pelle che anche inalata. Successivamente, facciamo vorticare tutti i campioni per alcuni secondi e li centrifughiamo a 13 RCF per cinque minuti dopo la centrifugazione.

All'interno dei tubi dovrebbero essere presenti due fasi. Dal momento che siamo interessati al contenuto della fase superiore, estrarremo la fase superiore e la metteremo in un tubo da due mil. Successivamente, a ciascun campione viene aggiunta una miscela di due microlitri di glicogeno e 50 microlitri di acetato di sodio a tre molari insieme a 1,375 mil di etanolo al cento per cento.

Tutti i campioni vengono vortici vigorosamente e posti a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, i campioni vengono posti su ghiaccio per scongelare. Sono centrifughe dense a 15 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela la natina SUP senza disturbare il pellet sul fondo della provetta. Quindi, aggiungi un mil di etanolo freddo al 75% a ciascun campione e capovolgili tutti da quattro a sei volte. I tubi vengono poi nuovamente centrati a 18 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Il surnatante viene nuovamente rimosso e i pellet vengono lasciati asciugare all'aria. Una volta che i pellet sono asciutti, vengono sciolti in 50 microlitri di tracce di HCL da quattro millimolari di PH otto e vengono conservati a meno 80 gradi Celsius. Fino a un nuovo utilizzo, beh, vi ho appena mostrato come fare le precipitazioni immunologiche della cromatina su tessuto cerebrale umano congelato post-mortem.

E ricorda, quando si esegue questa procedura, è importante prendere tutte le precauzioni necessarie quando si ha a che fare con il tessuto cerebrale umano, la cromatina, i saggi di immunoprecipitazione possono essere utilizzati per aggiungere un ulteriore livello di comprensione dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.