Name: Titolazione del coronavirus umani utilizzando un test immunoperossidasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Impara a titolare i coronavirus umani con il test immunoperossidasi, un metodo alternativo affidabile per virus senza effetti citopatici. Questa tecnica enzimatica consente la quantificazione accurata dei titoli virali.

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Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in <a href="http://www.springerprotocols.com/">protocolli di Springer</a> .

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

titolazione del coronavirus umani utilizzando un test immunoperossidasi

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Calcolo del infettive titoli virale rappresenta un approccio di base e sperimentali indispensabile per virologi. Saggi di placca classica non può essere utilizzato per i virus che non causino un rilevante effetto citopatico, che è il caso per i ceppi OC43 e 229E di coronavirus umani (HCoV). Un test alternativo immunoperossidasi indiretti (IPA) è qui descritto per la rilevazione e la titolazione di questi virus. Cellule sensibili vengono inoculate con diluizioni seriali logaritmica di campioni in una piastra da 96 pozzetti. Dopo una crescita virale, il rilevamento virale da IPA fornisce il titolo infettivo dei virus, espressa come &quot;Dose Tissue Culture Infettive&quot; (TCID50). Questo rappresenta la diluizione di un virus contenente campione a cui la metà di una serie di pozzi di laboratorio contengono virus replicante. Questa tecnica è un metodo affidabile per la titolazione di HCoV in campioni biologici (cellule, tessuti o fluidi).

In questo video, dimostriamo un metodo alternativo per il rilevamento e la titolazione di virus utilizzando una tecnica di rilevazione enzimatica antigene conosciuto come un saggio immunoperossidasi. Qui, vi mostreremo come raccogliere i campioni virali, preparare le cellule per il test, e infine il saggio immunoperossidasi utilizzando diluizioni seriali per determinare il titolo virale.

Titolazione del coronavirus umani utilizzando un test immunoperossidasi

La determinazione dei titoli virali infettivi è un approccio sperimentale fondamentale ed essenziale per i virologi. I classici saggi di placca non possono essere utilizzati per...

Il calcolo dei titoli virali infettivi è un approccio sperimentale fondamentale. Tuttavia, il metodo classico basato sui saggi di placca non è il più affidabile per i virus che non producono effetti citopatici, come nel caso dei coronavirus umani. In questo video, mostriamo un metodo alternativo per la rilevazione e la titolazione di un virus, che utilizza una tecnica enzimatica di rilevamento dell'antigene nota come saggio immunoperoxidasico.Qui vi mostreremo come raccogliere i campioni virali, preparare le cellule per l'analisi e, infine, eseguire il saggio immuno-perossidasi mediante diluizione seriale per determinare il titolo virale. Salve, mi chiamo Dr. Pierre Albo, direttore del Laboratorio di Neuroimmunologia presso l'istituto AM RIP di Laval, Quebec, Canada. Oggi dimostreremo come quantificare ceppi virali umani del virus del colore OT 43 e due nove E, che sono ceppi prototipici di questi virus che non producono placche in coltura.Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio per aggirare questo problema, chiamato saggio immunoperoxidasico. Per dimostrare questo protocollo, vi presenterò la mia studentessa Gabrielle Marol, il mio tecnico Francis Nader e la mia collaboratrice di ricerca Ellan Jacob.Iniziamo. Per prima cosa, dobbiamo preparare i campioni di tessuto. Cominciamo pesando in anticipo i tubi sterili che utilizzeremo per raccogliere ciascun organo.Dopo aver determinato il peso di ogni provetta vuota, procederemo rapidamente alla dissezione degli organi di interesse in condizioni sterili, per poi mantenerli sul ghiaccio. È importante ricordare di risciacquare gli strumenti con etanolo al 70% tra una dissezione e l'altra. Una volta raccolti gli organi, determiniamo il peso di ciascun campione biologico.Successivamente, omogeneizzeremo i campioni di tessuto con PBS sterile al 10% utilizzando un omogeneizzatore Polytron in una cappa a flusso laminare. Accendere l'omogeneizzatore quindi sollevare e abbassare il tubo per disgregare il tessuto. Dopo l'omogeneizzazione di ogni campione, lavare l'apparecchio una volta con acqua sterile, una volta con etanolo al 70% e infine con PBS prima di processare il campione di tessuto successivo.Dopo aver omogeneizzato i campioni, centrifugare i tubi a quattro gradi Celsius per 20 minuti. A 1000 G raccogliere i soprannatanti in nuovi tubi sterili. A questo punto, i campioni virali possono essere sottoposti a rilevamento mediante immunoperoxidasi.In caso contrario, puoi congelarli immediatamente a meno 80 gradi Celsius e conservarli fino al momento in cui sei pronto per eseguire i saggi. Successivamente, dobbiamo preparare i campioni cellulari. Esistono diversi metodi per la preparazione di cellule aderenti e non aderenti, ma entrambi prevedono la raccolta dei titoli virali intracellulari ed extracellulari.Per determinare la produzione virale extracellulare in cellule aderenti, raccogliamo i supernatanti in provette sterili dalle cellule infette, che devono essere analizzate nei tempi appropriati successivi all'infezione. Per la stima dei titoli virali intracellulari, si desidera innanzitutto rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS sterile e tiepido, quindi aggiungere lo stesso volume o un volume noto di mezzo e sottoporre a tre cicli di congelamento-scongelamento a meno 80 gradi Celsius. Questo provocherà la lisi delle cellule e il rilascio dei virioni nel mezzo.Per le cellule non aderenti, centrifughiamo innanzitutto le cellule a mille G per cinque minuti. Dopo aver formato il pellet cellulare, raccogliamo i soprannatanti in provette sterili. Questo rappresenta la frazione extracellulare del virus infettivo.Successivamente, sospendiamo il pellet cellulare nello stesso volume del soprannatante raccolto o in un volume noto di mezzo di coltura. Eseguiamo ora tre cicli di congelamento-scongelamento a meno 80 gradi Celsius per lisare le cellule e rilasciare le particelle virali nel mezzo. Questo rappresenta la frazione intracellulare del virus infettivo.Dopo la lisi di cellule aderenti o non aderenti, centrifugare per cinque minuti a mille g. A questo punto, il soprannatante può essere raccolto in nuovi tubi sterili e i titoli possono essere analizzati mediante saggio immunoperoxidasico. In alternativa, il campione può anche essere congelato immediatamente a meno 80 gradi C e conservato fino al momento dell'analisi.Per verificare la produttività dell'infezione da coronavirus umano nei nostri campioni biologici, si desidera utilizzare un saggio immunoperoxidasico su cellule suscettibili al coronavirus. Prima, un trattamento con tripsina viene utilizzato per creare una sospensione di cellule suscettibili da un monostrato confluito. Quando si lavora con il coronavirus umano, vengono impiegate le cellule 229E come cellule suscettibili, mentre per il coronavirus umano OC43 si utilizza la linea cellulare HRT-18, dopo aver ottenuto una sospensione di cellule suscettibili. Le cellule vengono quindi seminate in una piastra a 96 pozzetti per coltura tissutale.Se si utilizza una pipetta multicanale, distribuire cento microlitri per pozzetto di sospensione cellulare utilizzando la concentrazione appropriata di cellule. Il numero di cellule suscettibili per pozzetto dipenderà dal tipo di cellule utilizzate e dal momento in cui avverrà l'inoculo cellulare. Dopo la semina, consultare il nostro protocollo Springer per informazioni più dettagliate.Prima di iniziare il saggio immuno-perossidasi, le cellule suscettibili devono essere infettate con i campioni preparati in precedenza. Quando le cellule suscettibili hanno raggiunto una confluenza del 70-80%, rimuovere il mezzo da ogni piastra a 96 pozzetti avvolgendo la piastra in carta sterile e scuotendola delicatamente a faccia in giù su un altro foglio di carta sterile. Successivamente, aggiungere in ogni pozzetto cento microlitri di alpha MEM integrato con 1% di FBS.Ogni campione deve essere testato in quattro colonne adiacenti. Nella stessa piastra, aggiungere cento microlitri per pozzetto di aliquote da testare nella prima riga. Tipicamente, le cellule suscettibili vengono inoculate con diluizioni logaritmiche seriali dei campioni infetti.Per fare ciò, aggiungere nuovamente 11 microlitri per pozzetto dello stesso campione in quattro pozzetti. Ora, nella seconda riga della piastra a 96 pozzetti, mescolare con la pipetta multicanale aspirando e dispensando su e giù tre volte e trasferire 11 microlitri da ciascun pozzetto alla terza riga e così via fino all'ultima riga della piastra. Dopo aver inoculato le cellule, incubare le piastre in una camera umidificata a 33 gradi Celsius con 5%CO2 per il coronavirus umano.Le cellule infettate da 2290 vengono incubate per cinque giorni e quelle infettate dal coronavirus umano OC 43 per quattro. Trascorso questo tempo, possiamo procedere al rilevamento del virus.Dopo l'incubazione, siamo pronti a rilevare il virus. Iniziamo innanzitutto rimuovendo completamente il mezzo. Questo passaggio viene effettuato scuotendo le piastre su fazzoletti di carta non sterili all'interno della cappa a flusso laminare.Quindi risciacquiamo delicatamente le cellule riempiendo dolcemente le pozzette con PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, eliminiamo il PBS dalle pozzette e rimuoviamo ogni residuo di PBS avvolgendo ciascuna piastra in carta da filtro.Dopo aver lavato le cellule, è necessario fissarle con metanolo al cento per cento contenente perossido di idrogeno allo 0,3%. Aggiungere la miscela di metanolo alle cellule e lasciare riposare la piastra da 15 a 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di 30 minuti, rimuovere il fissativo scuotendo la piastra sopra il lavandino. Rimuovere il fissativo residuo scuotendo la piastra a faccia in giù su diversi fazzoletti di carta posizionati sul piano di lavoro.Quindi lasciarlo asciugare completamente all'aria, rivolto verso l'alto, per circa 15-30 minuti mentre le cellule si asciugano. Preparare una soluzione di anticorpi specifica per il virus, diluita nel PBS in modo appropriato. Successivamente, aggiungere cento microlitri dell'anticorpo virale specifico in ogni pozzetto delle piastre da incubare, per due ore a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, rimuovere completamente il mezzo svuotandolo nel lavandino. Lavare la piastra riempiendo le pozzette con PBS. Successivamente, svuotare la piastra nel lavandino e risciacquare con PBS.Altre due volte. Rimuovere tutto il PBS residuo scuotendo delicatamente verso il basso su fazzoletti di carta non sterili posizionati sul banco di lavoro. Successivamente, aggiungere cento microlitri per pozzetto di anticorpo secondario in rapporto 1:1000.Diluire in PBS, incubare la piastra per due ore a 37 gradi senza CO2, 30 minuti prima della fine dell'incubazione. Preparare il reagente di rilevamento, che è una miscela di DAB con PBS e perossido di idrogeno allo 0,01%. Risciacquare la piastra tre volte in PBS come fatto in precedenza.Dopo aver lavato la piastra, aggiungere cento microlitri di reagente di sviluppo in ciascun pozzetto. Incubare per 10-20 minuti a temperatura ambiente o fino a quando il controllo positivo non è colorato. Per arrestare la reazione, lavare la piastra una volta con acqua come precedentemente fatto con PBS e riempire ogni pozzetto con cento microlitri di acqua deionizzata.Infine, leggere le piastre al microscopio ottico per quantificare tutti i pozzetti che presentano cellule colorate. Ora, finalmente, possiamo determinare il titolo del nostro virus. Questo può essere calcolato utilizzando il metodo car, la cui equazione è disponibile nel protocollo Springer associato a questo video.Abbiamo appena mostrato come titolare i coronavirus umani durante questa procedura. È importante ricordare che si stanno utilizzando campioni contenenti entrambi i virus e che è necessario lavorare in condizioni sterili. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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