Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l'uso in 2-fotone Imaging

La preparazione di cellule dendritiche dal midollo osseo fornisce un'eccellente fonte di cellule presentanti l'antigene che possono essere utilizzate per esperimenti in vitro o in vivo nell'imaging a due pulsanti del sistema immunitario. L'introduzione di cellule presentanti l'antigene consente lo studio delle interazioni cellula-cellula antigene-specifiche nel contesto del linfonodo vivente. Qui dimostriamo l'isolamento sterile del midollo osseo e le tecniche di coltura per la produzione di cellule dendritiche mature.

Inoltre, seguiamo lo sviluppo delle cellule dendritiche dal primo all'undicesimo giorno. Questo sviluppo è rappresentato con immagini fisse e video dell'incubatrice realizzati utilizzando il sito incus di scent technologies. Infine, mostriamo che le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo presentano l'antigene di cove a due cellule T OT nel linfonodo specchiante.

Ciao, sono Melanie Matthew nel laboratorio di Micah Halen all'Università della California nelle vicinanze. Ti sei mai chiesto cosa succede all'interno durante il prober mentre le tue cellule stanno crescendo? Oggi?

Come parte del nostro protocollo, ti mostreremo come utilizzare alcuni strumenti in loco. Il sito inchiostrato consente di monitorare la crescita delle colture cellulari nell'incubatore. In questo protocollo, ti mostreremo come isolare e preparare cellule derivate dal midollo osseo e raggruppate dal topo.

Quindi la prima cosa che ti mostrerò come fare è rimuovere le ossa del femore e isolare il midollo osseo Per prima cosa appunta l'animale. Quindi, bagna l'animale con etanolo al 70%. Fai la tua prima incisione lungo la linea mediana dell'animale.

Poi tagliate l'interno della gamba come vi mostro qui. Per esporre il tessuto muscolare sopra il femore, dovresti essere in grado di tirare da parte il muscolo e afferrare il grande osso del femore con le pinzette da dissezione. Mentre tieni l'osso con le pinzette da dissezione, scendi lungo l'osso e fai il tuo primo taglio appena sotto l'articolazione.

Quindi lavora le forbici lungo la lunghezza del femore e fallo tagliare il più vicino possibile al corpo. Ciò può causare un po' di sangue, soprattutto se si taglia l'arteria femorale. Quando si rimuove il femore, è estremamente importante che l'osso sia mantenuto intatto.

Come potete vedere qui alle estremità dell'osso non sono stati tagliati o interrotti. Una volta rimosso il femore, ritaglia l'eventuale tessuto aggiuntivo e posiziona il femore in un piattino del nostro media PMI. Quando si rimuove il tessuto aggiuntivo, assicurarsi che l'osso del femore non si asciughi.

A questo punto, le ossa del femore devono essere trasferite in una capsula contenente il 70% di etanolo e poste sul ghiaccio per cinque-10 minuti. Ai fini di questo video, continueremo sul banco di laboratorio. Tuttavia, in questa fase dell'esperimento, tutto dovrebbe essere trasferito in una cappa di coltura tissutale.

Una volta che le ossa sono state immerse nell'etanolo, è possibile spostarle in un piatto più grande di terreno sterile per la rimozione del midollo osseo. Ora siamo pronti per rimuovere e risospendere il midollo osseo. Riempire una siringa da insulina con terreno sterile e posizionarla lateralmente per un uso successivo.

Afferra l'osso con le tue pinzette sterili. Tienilo sopra un piattino per i pezzi scartati e taglia l'epifisi o le estremità dell'osso da ciascun lato. Posiziona la siringa da insulina su un lato dell'osso e sciacqua il midollo dall'osso in 15 mil di terreno.

Lavare l'osso una o due volte fino a quando tutto il midollo non è stato espulso. Una volta che il midollo è stato espulso dall'osso, sarà quasi completamente bianco. Metti l'osso pulito nella capsula di scarto e ripeti il processo dell'altro femore.

Una volta completato, rompere delicatamente tutti i pezzi di midollo che non sono stati rotti dal processo di lavaggio per creare una sospensione a cellula singola. Questa operazione richiederà da cinque a 10 minuti di pipettaggio. Posizionare una sospensione a singola cellula in una provetta conica da 50 mil, lavare la piastra almeno tre volte con 10 mil di terreno.

Ogni volta, far girare le cellule, rimuovere il terreno e risospendere le cellule sfiorando con decisione e decisione le dita contro il fondo del tubo. Per rimuovere i globuli rossi o globuli rossi, eseguiamo una lisi dell'acqua. Un altro metodo per la rimozione dei globuli rossi è la lisi del cloruro di ammonio.

Entrambi i metodi sono stati descritti in precedenti articoli video di JoVE. Isolamento di quattro cellule T positive da linfonodi di topo utilizzando il numero nove di purificazione di Milano max e la preparazione del fattore di crescita delle cellule T da citi di ratto JoVE. Numero 10.

Dopo aver rimosso i vostri globuli rossi, ora siete pronti per la coltura di voi stessi. Quindi, prima di illustrarvi la coltura cellulare di denri, vorrei presentarvi il sito dell'incus. Il sito dell'incus consentirà di sottrarre la crescita della coltura cellulare all'interno dell'incubatore in modo da poter osservare noi stessi come si comportano o si comportano male.

Una volta impostata una coltura, la si posiziona nel vassoio delle dimensioni appropriate e si chiude il sito dell'incus. Quindi, sul tuo computer, devi semplicemente impostare l'intervallo di tempo e quindi scegliere i pozzetti che desideri visualizzare e lasciare che il sito inchiostrato raccolga i dati per te. I filmati ti mostreranno in questo protocollo, i cambiamenti della morfologia delle cellule dendritiche in vitro.

Questi video sono stati esportati direttamente dal programma del sito Incus. Man mano che le cellule dendritiche si sviluppano dal primo all'undicesimo giorno, è possibile vedere un vero cambiamento morfologico man mano che si ingrandiscono e assumono il fenotipo delle cellule dendritiche. Dopo la lisi, i globuli rossi e la loro rimozione, le cellule vengono lavate in terreni cellulari dendritici primari e piastrate a 5 milioni per mil.

Queste cellule dovrebbero essere inizialmente coltivate in terreni di coltura di cellule dendritiche primarie, e successivamente le coltiviamo in terreni DC secondari, che sono integrati con 40 nanogrammi per mil IL quattro e cento nanogrammi per mil TNF alfa. Queste citochine aiuteranno nello sviluppo di cellule dendritiche mature che assomigliano alle cellule dendritiche derivate dai monociti. Quindi ora ti mostrerò come appaiono le culture mentre si sviluppano e come mantenerle nel tempo.

Una volta piastrate le cellule, è possibile coltivare le cellule dendritiche per 72 ore prima del primo cambio di terreno. Ecco come apparirà la tua coltura tipica subito dopo aver piastrato le cellule il primo giorno. Ed ecco uno sguardo alle cellule.

Il terzo giorno, puoi vedere che le cellule hanno iniziato ad aderire alla placca ma non hanno assunto il classico fenotipo delle cellule dendritiche. Il quarto giorno, rimuovere il terreno e aggiungere 10 mil di terreno DC primario fresco di aspirazione del terreno. Il quarto giorno, rimuoveremo i linfociti in qualsiasi altra cellula non aderente.

Ora potete rimettervi nell'incubatrice per altri tre giorni, sette giorni dopo la placcatura iniziale. Ecco come sarà la tua cultura tipica. Puoi dire che è ora di dividere le celle e riprenderle.

Il settimo giorno, le cellule dendritiche vengono rimosse dalla piastra aspirando il terreno e quindi aggiungendo 300 millimolari di EDTA sterile e incubando questo per cinque minuti. Quindi la piastra viene risciacquata ripetutamente tenendola a un angolo di 45 gradi e pipettando la soluzione di EDTA contro il retro della piastra. Questo viene fatto per diversi minuti per assicurarsi di rimuovere tutte le cellule dendritiche aderenti.

Le cellule vengono raccolte in una provetta conica da 50 milli e lavate due volte con terreni CC secondari. Le cellule vengono quindi risospese e piastrate a 5 milioni di cellule per piastra. Le cellule dendritiche del settimo giorno appena ripiastate si depositano rapidamente sul fondo della piastra, aderiscono e iniziano a diffondersi.

Come potete vedere qui nel video del sito di Zichy, questo video è stato girato nell'incubatore nel corso di due giorni per mostrarvi lo sviluppo delle cellule dendritiche dalla riplaccatura iniziale effettuata il settimo giorno all'inizio del nono giorno. Le cellule dendritiche morfologiche possono essere attivate nell'impulso dell'antigene aggiungendo due microgrammi per LLPS qui con un centinaio di microgrammi per gli ovuli da utilizzare con cellule T purificate da due topi OT, che hanno quattro cellule T positive CD specifiche per gli ovuli. Se stai usando un antigene diverso, è importante assicurarsi di utilizzare una concentrazione ottimale di antigene per pulsare il tuo dcs qui, l'OV e l'LPS vengono aggiunti ai terreni primari in modo tale che la concentrazione finale di LPS sarà di due microgrammi per mil in 20 mil e gli ovuli saranno di cento microgrammi per mil in 20 mil.

Ecco una fotografia di come appare una tipica coltura di cellule dendritiche del giorno 10. In questa fotografia si può vedere che la morfologia è molto tipica di una cellula presentante l'antigene. Dovresti sempre controllare la percentuale di cellule dendritiche CD 11 C positive via fax.

Questo per garantire che tu abbia una coltura relativamente pura di cellule dendritiche da utilizzare nei tuoi esperimenti. Qui utilizziamo il sito inchiostrato degli strumenti SEN per monitorare l'attivazione delle cellule dendritiche che sono state trattate con LPS in antigene pulsato il giorno 10. Questo video copre un periodo di 24 ore immediatamente dopo l'aggiunta di LPS e del val e del peptide, e in esso le cellule dendritiche diventano più attive e ci sono alcuni evidenti cambiamenti morfologici.

Una volta che le cellule dendritiche sono state attivate nell'impulso antigenico, è possibile raccoglierle nuovamente mediante incubazione con EDTA da 300 millimolari e lavando la piastra. Ora gira le cellule, lavale due volte con 50 mil di terreno RPMI per rimuovere qualsiasi antigene aggiuntivo ed etichettale con il colorante tracker cellulare appropriato. In questo esperimento, eseguirò l'imaging delle cellule del linfonodo inguinale.

Avremo bisogno di iniettare da due a 5 milioni di cellule dendritiche per via cutanea nella regione del fianco del topo mostrato qui. Quindi lasciamo 24 ore affinché le cellule dendritiche ospitino il linfonodo di allenamento. Qui in questo video, le cellule dendritiche sono marcate con CMF two hc, un colorante tracciante di cellule blu.

È possibile vedere le cellule dendritiche interagire con le cellule T marcate che sono antigene specifico per la volina. Queste cellule T sono marcate con ccf SE. È inoltre possibile utilizzare C-M-T-M-R o uno qualsiasi degli altri coloranti traccianti cellulari per le sonde molecolari. Questa è la fase iniziale di attivazione delle cellule T che interagiscono con le cellule T in c.d.c.

Poiché sono antigene specifico, puoi vedere che le cellule T si attaccano ai viticci delle dcs etichettate in blu. Questo conclude il nostro protocollo che dimostra la preparazione e l'uso di cellule dendritiche di midollo osseo derivate dal topo in un esperimento di imaging a due bottoni. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.