Name: Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Impara il passaggio di cellule staminali embrionali umane da Matrigel a Matrigel senza feeder, usando dispasi e microscopia a immunofluorescenza per confermare la pluripotenza. Questo metodo garantisce colture ottimali per la ricerca.

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Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.

HESC scissione da Matrigel a Matrigel Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC su Matrigel possono essere divisi 1:03-01:05 ad un altro piatto Matrigel, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione. <ol><li> CM e le piastre Matrigel sono preparati come descritto in precedenza prima di sciogliersi. </li><li> Il giorno della scissione, lavare i pozzetti per la scissione con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di 1mg/ml dispasi (soluzione madre diluita 5mg/ml con DMEM/F12 media) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 3 min. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di ES media senza bFGF, usare un raschietto colonie di cellule per raschiare dal fondo del pozzo, raccogliere le hESC sospeso in un tubo da 50 ml falco, e pellet per centrifugazione a 200g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per ri-targhetta del hESC su piastre Matrigel, prima lavare i piatti con Matrigel DMEM/F12 e aggiungere 2,5 ml di CM integrata con 10ng/ml bFGF per bene. Risospendere il pellet in hESC un volume adeguato di CM integrata con 10ng/ml bFGF, pipetta la sospensione cellulare su e giù per tre volte. (NOTA: quando hESC per suddividere provengono da piastre Matrigel, le macchie sono molto facili da rompere, quindi tre cicli di pipettaggio è sufficiente e più pipettaggio può over-disturbare le colonie e fare singole cellule.) Aliquota 0,5 ml di sospensione hESC grumi per bene del 6-pozzetti Matrigel per ottenere 3 ml per oltre un volume finale. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C. </li></ol> Individuazione di marcatori di pluripotenza microscopia di immunofluorescenza Microscopia a immunofluorescenza è utilizzato per esaminare l&#39;espressione di marcatori hESC pluripotenza Oct-4 e SSE-4 durante la coltura. <ol><li> Aspirare multimediali da un pozzetto e lavare con 1 × PBS, pH 7,4. Aggiungere 2 ml di 3,7% di formaldeide al pozzo di correzione per 10 min. </li><li> Risciacquare con 1xPBS, pH 7,4, aggiungere 2 ml di metanolo al pozzo e posto a -20 ° C per 2 min. </li><li> Risciacquare con 1xPBS, pH 7,4, e blocco con 1 ml di 0,2% serume albumina bovina (BSA) per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di anticorpo Oct-4 o anti-h/mSSEA-4 (1:200 diluizione nel 0,2% di BSA), e incubare a temperatura ambiente per 1 ora oppure a 4 ° C per una notte. (NOTA: per SSE-4 macchie, passare direttamente al punto 6) </li><li> Lavare tre volte con 1xPBS, pH 7,4, aggiungere FITC-coniugato IgG di coniglio (1:500 diluizione nel 0,2% di BSA), e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare 3 volte con 1xPBS, pH 7,4, e mettere una goccia di soluzione di montaggio (può contenere DAPI visualizzazione nucleare se si vuole) al centro del pozzo. Mettere coprioggetto sopra delle celle, sigillare con smalto, e valutare al microscopio immunofluorescenza. </li></ol> Cellule staminali embrionali umane ricevute ES media (mezzi di cellule staminali embrionali): DMEM/F12 - 400ml Knockout siero Replacer - 100ml Aminoacidi non essenziali - 5ml 200mm GlutaMax / BME Solution - 5ml Penicillina / streptomicina - 5ml Mescolare bene e conservare finale Media Cultura hESC in bottiglie da 500ml a 4 ° C. Buono per un massimo di due settimane. MEF Cultura Media: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Aminoacidi non essenziali - 10ml Glutammina - 10ml Penicllin / streptomicina - 10ml Mescolare bene e conservare finale Media Cultura MEF a 4 ° C. 200mm Glutamax / BME Soluzione: Glutamax - 100ml β-mercaptoetanolo (Soluzione madre a 14,3 milioni) - 140 μ1 Mescolare due soluzioni bene e poi porzioni da 10 ml aliquota. Mantenere aliquote a -20 ° C. bFGF Soluzione (concentrazione finale di magazzino: 10 microgrammi / ml): bFGF (FGF2) - 50 mcg BSA 0,1% nel 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml Sciogliere 50 microgrammi bFGF in 5ml BSA 0,1% per fare un 10 mcg / ml di brodo. Aliquotare in porzioni da 500 microlitri. Conservare a -80 ° C. Collagenasi IV Soluzione (1mg/ml): Collagenasi IV - 50mg DMEM/F12 Media - 50ml Aggiungere la polvere di collagenasi IV in una provetta da 50 ml falco. Nel cofano, mescolare in 50ml di sterili DMEM/F12 media. Vortex la soluzione per &lt;1 min. per assicurarsi che la polvere è sciolta. Nel cofano, passare attraverso un filtro di 0,22 micron in un nuovo tubo sterile da 50ml falco. Questa soluzione è buona per un massimo di 2 settimane conservato a 4 ° C. Dispasi Soluzione (1mg/ml): Dispasi 5mg/ml - 2ml Media DMEM/F12 - 8ml Aliquota commerciale 5mg/ml soluzione dispasi e conservare a -20 ° C. Diluire dispasi a 1mg/ml utilizzando DMEM/F12. Questa soluzione può essere conservata per 1 settimana a 4 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Questa serie di 3 video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione (video 1), come passaggio a Matrigel cell-free alimentatore piastre (video 2), e come mantenere hESC da passaging in alimentatore Matrigel condizioni cell-free (video 3). Numerosi studi precedenti hanno mostrato che il mantenimento della vitali, hESC indifferenziato richiede cultura sulle cellule inattivate alimentatore MEF. Tuttavia, per molti esperimenti, una popolazione pura di ...

<table><tbody><tr><td>Sostituto del siero per knockout (KSR)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagente</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Stretomicina </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct-4</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo IgG3 coniugato con fito&amp;#8211;eritrina anti-h/mSSEA-4</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato con FITC</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

dal mef per matrigel 3: hesc passaging da matrigel su matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata.

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.

Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

Questo video dimostra come mantenere la crescita di cellule staminali embrionali umane (hESC) in condizioni prive di cellule feeder e come effettuarne il passaggio continuo...

Per suddividere cellule staminali embrionali umane coltivate su Matrigel due matrigel. Si parte da una piastra a sei pozzetti confluenti di cellule staminali embrionali su matrigel, che possono essere suddivise da uno a tre, da uno a cinque, in un'altra piastra di matrigel. Ciò consente ai pozzetti di diventare di nuovo confluenti, quattro-cinque giorni dopo il passaggio, nel giorno stesso del passaggio.Lavare ogni pozzetto che verrà suddiviso con un XPBS pH 7,4. Quindi aggiungere un millilitro di una soluzione di un milligrammo per millilitro di dis pasta in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Lavare ogni pozzetto tre volte con un XPBS pH 7,4.Quindi aggiungere un millilitro di mezzo per cellule staminali embrionali senza BF GF e utilizzare un raschietto per cellule per staccare le colonie dal fondo della pozzetta. Raccogliere le cellule staminali embrionali sospese in un tubo Falcon da 15 millilitri e formare il pellet mediante centrifugazione a 200 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Per reimpiantare le cellule staminali embrionali umane su piastre con matrigel, lavare innanzitutto le piastre con matrigel con D-M-E-M-F 12 e aggiungere 2,5 millilitri di mezzo Meth Condition integrato con 10 nanogrammi per millilitro.BFGF per pozzetto dopo che le cellule sono state centrifugate, risospendere il pellet di cellule staminali auricolari umane in un volume appropriato di condizione metilica. Aggiungere al mezzo 10 nanogrammi per millilitro di BFGF e pipettare la sospensione cellulare su e giù per tre volte.Tenere presente che gli aggregati di cellule staminali provenienti dal matrigel si frammentano facilmente. Pertanto, un’aspirazione e dispersione con pipetta per tre volte dovrebbe essere sufficiente per rompere gli aggregati, senza rendere troppo piccole le colonie. Infine, aliquotare 0,5 millilitri di sospensione di cellule staminali umane per pozzetto, ottenendo così tre milioni di cellule per pozzetto.Come volume finale, assicurarsi che gli aggregati cellulari siano uniformemente dispersi, quindi posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi. A seconda della specifica linea di cellule staminali amry, le cellule staminali amry diventeranno di nuovo confluenti da quattro a cinque giorni dopo la suddivisione. Quando le colonie inizieranno a toccarsi tra loro, è importante verificare se le cellule staminali amry umane mantengono la pluripotenza o la caratteristica staminale in coltura.Per verificare la pluripotenza delle cellule durante la coltura di cellule staminali, utilizziamo la microscopia a fluorescenza immunoistochimica per esaminare l'espressione dei marcatori di pluripotenza, OCT4 e SSEA-4, in uno dei pozzetti. La nostra piastra a sei pozzetti viene fissata e colorata per OCT4 e SSEA-4. Se osserviamo che le cellule sono marcate fluorescentemente per entrambi questi marcatori, allora sappiamo che le nostre cellule staminali embrionali umane hanno mantenuto la pluripotenza e possono essere utilizzate per i nostri esperimenti.Abbiamo appena mostrato come coltivare e mantenere cellule staminali embrionali umane potenti, tra embrioni, fibroblasti, cellule feeder e in condizioni prive di campo su metro job. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina.

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Parte 1 di 3.

Dal MEF per Matrigel I: hESC Passaging in presenza di MEF

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 2 di 3.

Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

Regia di hESC differenziazione in cellule specifiche, ha generato molto interesse nella medicina rigenerativa. Forniamo un conciso, passo-passo il protocollo per la determinazione...

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Per evitare le limitazioni associate al passaggio enzimatico o meccanico di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) coltivate su cellule feeder, abbiamo stabilito un metodo rapido, efficace, economico e ad alto rendimento per la raccolta di colonie hESC o hiPSC mantenute su uno strato di cellule feeder di fibroblasti prepuzi umani utilizzando la disadesione mediata da EDTA.

Passaggio rapido, economico e privo di enzimi di cellule staminali pluripotenti umane su cellule nutritrici mediante disadesione mediata dall'acido etilendiamminotetraacetico

Impara il passaggio di cellule staminali embrionali umane da Matrigel a Matrigel senza feeder, usando dispasi e microscopia a immunofluorescenza per confermare la pluripotenza. Questo metodo garantisce colture ottimali per la ricerca.

Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

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