Imaging Effector cellule T di memoria nell'orecchio dopo l'induzione di DTH adottivi

Ciao, sono Melanie Matthew. Sono una studentessa laureata nel laboratorio di Micah Hollins presso l'Università della California, Irvine, nel Dipartimento di Fisiologia e Biofisica. Oggi, insieme alla dottoressa Christine Beaton, vi mostreremo come otteniamo l'immagine della popolazione di linfociti T effettrici o della memoria nella pinna auricolare del ratto.

La dottoressa Christine Beaton indurrà innanzitutto l'ipersensibilità di tipo ritardato DTH nell'orecchio del ratto. Successivamente passeremo all'imaging in situ dell'orecchio del ratto mediante due microscopie foto. Due giorni fa ho iniettato cellule T specifiche per l'albumina marcate con GFP in un Lewis iper.

Oggi sottoporrò lo stesso ratto a un test nell'orecchio. Nell'orecchio destro inietterò dell'albumina, mentre nel sinistro inietterò semplicemente del PBS.

La dose di albumina che sto iniettando è di 20 microgrammi in 20 microlitri. L'albumina che utilizzo è una miscela uno a uno di albumina marcata con Texas Red e albumina non marcata. Questo è il punto in cui vi mostrerò come procederò con l'iniezione.

Quindi ho la mia mano sinistra, sono destro. Con la mano sinistra ho tolto il guanto per poter inserire un dito sotto l'orecchio e l'altro sopra, in modo da tendere la pelle e vedere esattamente dove si trova l'ago, penetrando tra i due strati di pelle nell'aria, che è molto sottile. Per questo utilizzo aghi da 27 gauge, in modo da avere qualcosa di estremamente sottile da inserire.

Quindi, se lo ruoto, si vede chiaramente dove è andato il Texas red e dove è andato il PBS. Siamo ora a 42 ore dal trattamento e utilizzerò un micrometro a molla per misurare lo spessore dell'orecchio. Misurerò entrambe le orecchie, l'orecchio destro che è stato trattato con l'albumina e l'orecchio sinistro che non è stato trattato, e la differenza di spessore ci fornirà un'indicazione dell'intensità dell'infiammazione.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 o 58 o 57 o 57. E l'altro orecchio 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Ciao. Allora, Christine Beaton ci ha appena consegnato il ratto che ha prelevato dopo la misurazione della risposta DTH.

Li abbiamo trasportati fin qui su ghiaccio. Questo è l'orecchio sinistro del ratto. E ora siamo nel laboratorio di Ian Parker per eseguire la microscopia a due fotoni.

Quindi preparerò queste orecchie per l'immagineggiamento in situ a due fotoni. Preparerò una delle orecchie del ratto alla base dell'orecchio. Il tessuto è molto più spesso e abbiamo dei peli che si sollevano, il che risulterà un po' disordinato se inizio semplicemente a tagliare.

Quindi, la prima cosa che farò è tagliare un po' di quel pelo. Sto tenendo delicatamente l'orecchio. Il mio dito rende molto più facile controllare il tessuto quando lo si tiene tra pollice e indice.

Preferisco farlo con le dita piuttosto che con le pinzette, perché con le pinzette non riesco a percepire bene quello che sta facendo il tessuto, e siamo sempre preoccupati di danneggiarlo. Perciò vogliamo poter sentire quello che stiamo facendo. Ecco perché preferisco usare le dita.

Questo è lo strato dermico che si stacca qui dall'orecchio del ratto. Mentre rimuovevo parte del pelo, sono riuscito a tagliare delicatamente alcune porzioni di derma che si staccano facilmente. Per farlo, utilizzo delle forbici da dissezione molto piccole, preferibilmente leggermente curve.

Non si vuole forare il tessuto e si può procedere dalla base dell'orecchio verso l'alto, tagliando delicatamente alcuni strati dermici. Non abbiamo bisogno di una finestra molto grande per l'immagine. Quest'area proprio qui sarà sufficiente per ottenere delle buone immagini delle cellule che infiltrano il tessuto.

Così potete vedere che abbiamo alcuni vasi sanguigni intatti ancora presenti alla base dell'orecchio e praticamente per tutta la sua lunghezza fino alla punta. Tutto questo settore sarà ideale per l'analisi dell'ipersensibilità ritardata (DTH). Procederò quindi a tagliare il frammento di tessuto che ho esposto, per ottenere un piccolo pezzo di tessuto che potremo incollare sulla nostra piastra per l'immagine.

Quindi, effettuiamo un taglio qui, giriamolo. Posso tagliare qui. Abbiamo un bel pezzetto di tessuto che possiamo preparare sul nostro microscopio a due fotoni per l'acquisizione di immagini.

Questi sono vetrini di plastica infrangibili che tagliamo alle dimensioni del nostro tessuto. Quindi montiamo il tessuto su questi utilizzando la colla bet. Successivamente fissiamo i vetrini di plastica infrangibili con grasso al silicone al nostro piano di imaging per analisi in situ.

Prenderò questo piccolo pezzo di tessuto auricolare, che presenta una leggera curvatura, quindi dovrò appiattirlo mentre lo incollerò. Non è l'ideale, ma funzionerà. Quindi prendete uno di questi coprioggetti e lo tagliate, stimando approssimativamente le dimensioni del vostro orecchio, e lo tagliate leggermente più grande di quanto pensiate sia necessario.

Per montare il nostro tessuto sul vetrino, utilizziamo una colla super resistente sicura per i tessuti chiamata Bet Long. La otteniamo da 3M e ne mettiamo semplicemente alcune gocce sul vetrino.

Non voglio avere troppo materiale. Inoltre, è necessario assicurarsi che sia distribuito in modo uniforme. Prenderò quindi un piccolo pezzo di carta per lenti e userò l'angolo per spalmare la colla attraverso il vetrino qui.

Si alzerà leggermente a causa della colla in eccesso e, non appena questa colla entra in contatto con l'acqua, si polimerizzerà. Pertanto, è necessario essere molto accurati con il campione di tessuto. Prenderò quindi un angolo del tessuto, una parte che probabilmente non verrà immaginata perché si trova sulla sezione curva.

Lo asciugherò solo un pochino. La parte inferiore, proprio sulla carta per lenti, in modo che si asciughi completamente. E toccherò con l'angolo, questo tessuto dell'orecchio di ratto, al vetrino coprioggetto.

E dovrebbe guarire immediatamente nella zona che ho toccato. Il resto, lo appiattirò leggermente premendo con delicatezza sui bordi. In questo modo, speriamo di ottenere un buon campo visivo per l'immagine.

Ora procederò a indurire la colla immergendola nel mezzo. Per evitare che la colla venga a contatto con la superficie del tessuto, capovolgiamo il preparato e immergiamo lentamente un angolo alla volta nel nostro serbatoio di mezzo; in questo modo dovrebbe aderire correttamente, consentendoci di acquisirne l'immagine all'interno della camera per l'analisi istologica. A questo punto, montiamo sul palchetto il frammento di tessuto preparato per l'analisi in situ, ovvero il pezzo di tessuto di birra.

Ecco il nostro frammento di tessuto con la vaselina siliconica sulla parte inferiore; lo posizioniamo delicatamente nel flusso del mezzo. Ora è attaccato al fondo della piastra grazie alla vaselina siliconica. Aumentiamo il flusso del mezzo con la nostra sonda di temperatura posizionata proprio accanto.

Ora ci concentreremo. Quindi accenderò la nostra illuminazione per la messa a fuoco, la nostra luce intensa. Prenderò l'obiettivo 20x e lo abbasserò nella camera.

Assicurarsi che non tocchi il tessuto. Guardare attraverso l'oculare e mettere a fuoco il tessuto dell'orecchio. Ed eccolo qui.

Qui si osservano follicoli piliferi verdi autofluorescenti nel derma dell'orecchio del ratto. Intorno a questi follicoli piliferi si trova uno strato denso di collagene. Questo è uno strato che rimuoviamo per l'imaging di cellule T fector memory mediante fotoni T.

I follicoli piliferi autofluorescenti ostacoleranno l'immagine, così come il collagene luminoso dello strato dermico superiore. Quindi, qui potete vedere che abbiamo cellule presentanti l'antigene (APC) che hanno incorporato la volina coniugata con Texas red, e sono adagiate lungo queste fibre di collagene blu. Le fibre di collagene appaiono blu a causa della generazione di armoniche di secondo ordine che si verifica nell'immagine a fotoni lungo le fibre di collagene.

Abbiamo linfociti T altamente mobili. Si muovono lungo le fibre di collagene e interagiscono con le APC. In questo video avete visto la dottoressa Christine Beaton indurre una DTH adottiva nel ratto Lewis.

E poi vi abbiamo mostrato il nostro preparato auricolare per l'immagine, le cellule della memoria T effettrici responsivi, l'orecchio del ratto e le nostre tecniche a due fotoni per realizzarla.