Imaging Effector cellule T di memoria nell'orecchio dopo l'induzione di DTH adottivi

Ciao, sono Melanie Matthew. Sono uno studente laureato nel laboratorio di Micah Hollins presso l'Università della California Irvine nel Dipartimento di Fisiologia e Biofisica. E oggi, insieme alla dottoressa Christine Beaton, vi mostreremo come immaginiamo l'effetto di risposta o la popolazione di cellule T di memoria nell'orecchio di ratto.

La dottoressa Christine Beaton indurrà per prima cosa l'ipersensibilità di tipo ritardato DTH nell'orecchio di ratto. E poi passeremo all'imaging in situ dell'orecchio di ratto mediante due fotomicroscopie. Due giorni fa ho iniettato GFP marcato di cellule T specifiche per albumina in iper a un Lewis.

E oggi sfido lo stesso topo nell'orecchio. Quindi nell'orecchio destro inietterò dell'albumina. E nell'orecchio sinistro mi inietterò un po' di PBS.

La dose di albumina che sto iniettando è di 20 microgrammi in 20 microlitri. E l'albumina che sto usando è una miscela uno a uno di Texas Red etichettato di albumina e non etichettato di albumina. Quindi questo è il verso giusto su cui vi mostrerò come iniettare.

Ho la mano sinistra, sono destrorsa. Quindi ho tolto il guanto alla mano sinistra per poter mettere un dito sotto l'orecchio e l'altro sopra per allungare la pelle in modo da poter vedere esattamente dove mi trovo con l'ago e andare tra i due strati di pelle nell'aria, che è molto sottile. Quindi per questo uso ferri calibro 27 per avere qualcosa di estremamente sottile da inserire.

Quindi, se lo giro, capisci sicuramente dove è andato il rosso del Texas e dove è andato il PBS. Quindi ora siamo a 42 ore dalla sfida e userò un micrometro a molla per misurare lo spessore dell'orecchio. Quindi misurerò entrambe le orecchie, l'orecchio destro che è stato sfidato con l'albumina e l'orecchio sinistro che non è stato sfidato e la differenza nel tuo spessore ci darà un'idea dell'intensità dell'infiammazione.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 o 58 o 57 o 57. E l'altro orecchio 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton ci ha appena dato il ratto che ha rimosso dopo aver misurato la risposta DTH.

Li abbiamo trasportati qui sul ghiaccio. Questo è l'orecchio sinistro del ratto. E ora siamo qui nel laboratorio di Ian Parker a fare due microscopie a fotoni.

Quindi preparerò queste orecchie per l'imaging in situ a due fotoni. Quindi preparerò una delle orecchie di topo qui alla base dell'orecchio. Il tessuto è molto più spesso e abbiamo dei peli che spuntano che saranno un po' disordinati se inizio a tagliarli.

Quindi la prima cosa che farò è tagliare un po' di quei capelli. Sto solo tenendo delicatamente l'orecchio. Il mio dito rende molto più facile controllare il tessuto quando lo tieni tra il pollice e l'indice.

Lo preferisco all'uso del forcipe perché il forcipe, semplicemente, non riesco a sentire cosa sta facendo il tessuto con la stessa facilità e siamo sempre preoccupati di danneggiare il tessuto. Quindi vogliamo essere in grado di sentire cosa stiamo facendo con esso. Quindi mi piace usare le dita.

Questo è lo strato dermico che si stacca da qui nell'orecchio del ratto. Quindi, mentre stavo tagliando via alcuni dei peli, sono stato in grado di tagliare delicatamente alcuni di quei peli del derma. Ci sono alcune forbici da dissezione molto piccole per farlo, quindi solo delle belle forbici curve.

Non vuoi colpire il tessuto e puoi risalire dalla base dell'orecchio verso l'alto, tagliando via delicatamente un po' di strato dermico. Quindi non abbiamo bisogno di una finestra molto grande per l'imaging. Quest'area proprio qui sarà sufficiente per ottenere alcune, alcune belle immagini delle cellule che si infiltrano nel tessuto.

Quindi puoi vedere che abbiamo ancora alcuni vasi sanguigni intatti qui alla base dell'orecchio e praticamente fino alla punta dell'orecchio. L'intera area sarà davvero utile per l'imaging DTH. Quindi andrò avanti e taglierò quel pezzo di tessuto che ho esposto per creare un piccolo pezzo di tessuto che possiamo incollare al nostro stadio di imaging.

Quindi fai un taglio qui, giralo. Posso tagliare qui. Abbiamo un bel pezzo di tessuto che possiamo preparare sul nostro cannocchiale a due fotoni per l'imaging.

Si tratta di vetrini di plastica infrangibili che tagliamo in base alle dimensioni del nostro tessuto. E poi montiamo il tessuto su questi usando il bet bond. E poi fissiamo questi vetrini coprioggetti in plastica infrangibile utilizzando grasso siliconico al nostro stadio di imaging in situ.

Prenderò questo piccolo pezzo di tessuto d'aria, ha una piccola curvatura, quindi dovrò appiattirlo mentre lo incolla. Non è l'ideale, ma funzionerà. Quindi basta prendere uno di questi vetrini coprioggetto e tagliarlo, stimare la dimensione del tuo orecchio e tagliarlo un po' più grande di quanto pensi che sarà.

Per montare il nostro fazzoletto sul vetrino coprioggetto. Usiamo una super colla sicura per i tessuti chiamata bet long. Lo prendiamo da 3M e ne mettiamo un paio di gocce sul nostro vetrino coprioggetto.

Non voglio averne troppo. E vuoi anche assicurarti che sia distribuito equamente. Quindi prenderò un pezzetto di carta per lenti e userò l'angolo per far passare la colla sul vetrino coprioggetti qui.

Andando a così su un po 'con la colla extra e non appena questa colla tocca l'acqua, si indurirà. Quindi è necessario prestare molta attenzione al campione di tessuto. Quindi prenderò l'angolo di tessuto qui che probabilmente non immagineremo perché è sulla parte curva.

Lo asciugherò solo un po'. Il fondo, solo sulla carta delle lenti in modo che sia tutto asciutto. E sto per toccare l'angolo di esso, questo fazzoletto per orecchie di ratto al vetrino coprioggetto.

E dovrebbe polimerizzare immediatamente dove l'ho toccato. Per il resto, mi appiattirò un po' premendo delicatamente su di esso, sui bordi. Quindi speriamo di poter avere una bella cornice di immagini.

Quindi ora quello che farò è polimerizzare la colla immergendola in un supporto. Quindi, per evitare che la colla penetri sopra il tessuto, la capovolgiamo e la immergiamo lentamente in un angolo nel nostro serbatoio di terreno e dovrebbe essere ben incollata e possiamo immaginarla nella nostra camera di imaging tissutale. Quindi ora monteremo il pezzo di tessuto che abbiamo preparato per l'imaging in situ, il pezzo di tessuto di birra sul palco.

Quindi ecco il nostro pezzo di tessuto con il grasso siliconico sul fondo, e lo posizioniamo delicatamente nel flusso del fluido. Ora è attaccato al fondo del palco è il grasso al silicone. Illumina il flusso dei fluidi con la nostra sonda di temperatura proprio accanto ad essa.

E ora ci concentreremo. Quindi accenderò la nostra attenzione, la nuova luce, la nostra buccia luminosa. Quindi prenderò il nostro obiettivo 20 x e lo abbasserò nella camera.

Assicurati che non tocchi il fazzoletto. Guarda attraverso l'oculare e concentrati sul nostro tessuto auricolare. Ed eccolo qui.

Qui si vedono follicoli piliferi verdi autofluorescenti nello strato dermico dell'orecchio di ratto. Intorno a questi follicoli piliferi c'è un denso strato di collagene. Questo è uno strato che rimuoviamo per l'imaging del fotone T delle celle di memoria del T fector.

I follicoli piliferi autofluorescenti oscureranno l'immagine come il collagene luminoso dello strato dermico superiore. Ok, quindi qui potete vedere che abbiamo APC che hanno assorbito la volina coniugata rossa del Texas, e sono annidate lungo queste fibre di collagene blu. Le fibre di collagene sono blu a causa della generazione di seconda armonica che otteniamo nell'imaging dei fotoni lungo le fibre di collagene.

Abbiamo tcell altamente mobile. Strisciano su e giù per le fibre di collagene e interagiscono con gli APC. Quindi in questo video avete visto la dottoressa Christine Beaton, indurre l'adozione di DTH nel ratto Lewis.

E poi vi abbiamo mostrato la nostra preparazione all'orecchio per l'imaging, le cellule di memoria dell'effettore T reattivo, l'orecchio di ratto e le nostre due tecniche fotoniche per farlo.