Name: Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri come isolare nuclei neuronali da tessuto cerebrale umano postmortem per studiare le interazioni cromatiniche e l'espressione genica specifica. Questo protocollo migliora la risoluzione nelle ricerche epigenetiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori apprezzano la consulenza e il supporto tecnico fornito dal Dr. Richard Konz e del personale presso l&#39;impianto di base Citometria a flusso presso l&#39;Università del Massachusetts Scuola Medica. Risorse di base sostenuto dalla Endocrinologia Diabetes Research Center di Grant DK032520 sono stati utilizzati anche. Questo lavoro è supportato anche da finanziamenti del National Institute of Mental Health (NIMH), l&#39;Istituto Nazionale di Drug Abuse (NIDA) e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano.

Nuclei di estrazione <ol><li> Mettere 250 mg di tessuto cerebrale post-mortem congelato in 5 ml di Lysis Buffer 1 in douncer e posizionarlo sul ghiaccio. Per ricevere circa 5 milioni di nuclei dopo FACS ordinamento, useremo 1000 mg di tessuto per campione. </li><li> Una volta che il tessuto si è scongelato, dounce il tessuto per 1 minuto, mentre sul ghiaccio. </li><li> Prendete il tessuto omogeneizzato e posizionarlo in un tubo da 15 ml ultracentrifuga chiaro. Mettere la provetta in ghiaccio. </li><li> Prendere 9 mL di soluzione di saccarosio 2 con una pipetta, mettere la pipetta sul fondo della provetta ultracentrifuga chiaro, e rilasciare la soluzione di saccarosio 2 per creare un gradiente di concentrazione con la soluzione del tessuto omogeneizzato in cima alla soluzione di saccarosio 2. </li><li> Pesare i tubi ultracentrifuga per assicurarsi che saranno tutti bilanciati durante la rotazione all&#39;interno del ultracentrifuga. Apportare eventuali modifiche al peso con l&#39;aggiunta di Lysis Buffer 1 al livello superiore. </li><li> Dopo che i tubi sono stati pesati, li posto in secchi del rotore. </li><li> Mettere tutti i secchi in un rotore SW28 e con attenzione il rotore posto in ultracentrifuga. </li><li> Ultracentrifuga i campioni a 107.163,6 RCF per 2,5 ore a 4 ° C. </li><li> Una volta che la centrifugazione, rimuovere il supernatante, insieme con lo strato di detriti trovati al gradiente di concentrazione, con l&#39;uso di un vuoto, facendo attenzione a non disturbare il pellet contenente i nuclei sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 500 ml di PBS 1X a ciascun pellet e lasciate riposare in ghiaccio per 20 minuti. Questo permette al pellet per sciogliere un po &#39;da sola, rendendo più facile per poi meccanicamente sciogliere pipettando su e giù, che riduce la quantità di stress dell&#39;esperienza nuclei. </li><li> Dopo i nuclei sono incubati in ghiaccio per 20 minuti, meccanicamente pipetta su e giù per sciogliere completamente i nuclei all&#39;interno 1XPBS. </li><li> Rimuovere i nuclei contenenti soluzione dai tubi ultracentrifuga e combinare il contenuto di due tubi in un unico tubo di 2 ml microcentrifuga. Ancora una volta, posto i campioni sul ghiaccio. </li></ol> Immunocolorazione per FACS <ol><li> A questo punto, fare una miscela composta immunocolorazione di anticorpi primari e secondari, e blocco Mix. Per ogni campione, unire 300 ml di 1XPBS contenente 1,2 ml di anticorpi NeuN, 100 ml di miscela di blocco, che contiene 0,5% di BSA e il 10% siero di capra normale in 1XPBS, e 1 ml di Alexa Fluor 488. Per i campioni di controllo, escludere la NeuN primario di anticorpi e, invece, è sufficiente aggiungere altre 1XPBS. </li><li> Vortex la miscela immunocolorazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Mentre la miscela colorazione è in incubazione, fanno i controlli per i campioni. Per FACS ordinamento, un campione, che contiene nuclei sola, chiamata &quot;controllo senza macchia&quot; è necessario, un secondo campione, un controllo negativo, che contiene i nuclei con l&#39;anticorpo secondario Alexa Fluor 488 senza il NeuN anticorpo primario è anche necessario. </li><li> Aliquota 20 l di nuclei che contiene la soluzione in una provetta contenente 2 ml 1XPBS per il controllo senza macchia, e un altro 20 l in un altro tubo da 2 ml contenente 980 uL di 1XPBS per il controllo negativo. Aumentare il volume dei nuclei contenenti campioni di nuovo fino a 1 ml con 1XPBS. Tutti i campioni sono posti di nuovo sul ghiaccio. </li><li> Ora che la miscela immunocolorazione ha finito di incubazione, aggiungere il suo contenuto di 401 microlitri in campioni appropriati. Il campione nuclei riceverà la miscela contenente sia NeuN e Alexa Fluor 488, mentre il campione negativo riceverà la miscela contenente solo l&#39;anticorpo secondario Alexa Fluor 488. </li><li> Prendete i campioni nella stanza fredda per ruotare al buio per 45 minuti. </li><li> Dopo che i campioni sono incubati al buio per 45 minuti, metterli su ghiaccio e portarli alla struttura FACS. Durante il trasporto verso l&#39;impianto FACS, i campioni devono essere tenuti sul ghiaccio e al buio. </li></ol> FACS <ol><li> Presso l&#39;impianto di FACS, filtrare il campione attraverso un filtro di 40 um. Poi, li attraversano lo strumento per pochi minuti, pur essendo tenuti a freddo, al fine di ottenere alcuni dati preliminari prima della cernita. </li><li> A questo punto, è necessario impostare le porte appropriate richieste per l&#39;ordinamento. Diverse porte differenti sono usati per i campioni sorta. Il primo cancello dà un&#39;idea delle dimensioni dei nuclei diversi trovato all&#39;interno del campione, e permette separatation di detriti da nuclei reali. La seconda porta ci permette di ordinare i nuclei singolarmente. Scartare qualsiasi aggregati vengono scartate a questo punto. Infine, la terza porta è impostata su una specifica lunghezza d&#39;onda di fluorescenza, equivalente a quella del fluorocromo trovato nel nostro anticorpo secondario. Ponendo questa porta ci permette di ordinare e + NeuN separati, quindi nuclei neuronali da NeuN - nuclei. </li><li> Dopo che tutti i cancelli sono stati scelti, i nuclei possono essere ordinate in 1XPBS. </li><li> Una volta che ilintero campione è passato attraverso, verificare la purezza del genere eseguendo una aliquota del campione ordinati attraverso lo strumento. Assicurarsi che la fluorescenza del campione non si sviluppa, ma è contenuta all&#39;interno di un quadrante singolo. E &#39;meglio scegliere i campioni che sono oltre il 90% puro. </li></ol> Dopo FACS <ol><li> Una volta che il campione è stato ordinato, il trattamento dei nuclei può cominciare. Prendere 10 ml di campione ordinati e aggiungere ad esso 2 mL di soluzione di saccarosio 2, 50 uL di 1M CaCl 2 e 30 ul di 1m Mg (Ace) 2. Come promemoria, sempre essere sicuri di mantenere il campione in ghiaccio in quanto i nuclei sono non fissata. </li><li> Se c&#39;è meno di 10 ml di campione ordinati, alzare il volume fino a 10 ml con l&#39;aggiunta di 1XPBS, o regolare il materiale aggiuntivo di conseguenza. </li><li> Invertire il campione più volte e posto in ghiaccio per 15 minuti. </li><li> Dopo che i campioni sono incubati in ghiaccio per 15 minuti, le centrifughe in un rotore swing a 1786 RCF per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatante con l&#39;uso di un vuoto, senza disturbare il pellet bianco trovato sul fondo della provetta. </li><li> Sciogliere il pellet in 200 ml di soluzione di qualunque avete bisogno per gli esperimenti di procedere, e pipetta su e giù. </li><li> Trasferire la soluzione in un tubo più piccolo e metterlo nel congelatore ° -80 C fino a quando un ulteriore uso. </li></ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

Il protocollo presentato qui dovrebbe essere particolarmente utile per gli studi focalizzati sui cambiamenti epigenetici della cromatina neuronale e, più in generale, sul fenotipo molecolare del nucleo neuronale, durante il normale sviluppo delle malattie e l&#39;invecchiamento, o neurologici o psichiatrici. Il metodo è particolarmente vantaggioso quando l&#39;eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale, tra cui i potenziali cambiamenti nei neuroni-to-glia razione durante il corso di invecchiamento oa causa di malattia sono un problema <su...

Reagenti: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysis Buffer </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Saccarosio </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 microlitri </td></tr><tr><td> 0.1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 microlitri </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Regolare il volume a 50 ml con acqua autoclavato </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Soluzione di saccarosio </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Saccarosio </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 microlitri </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 microlitri </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Regolare il volume a 50 ml con acqua autoclavato </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampone </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Regolare il pH a 7,5 e il volume a 200 ml con acqua autoclavato </td></tr></table>

nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano postmortem

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuroni nel cervello umano si postmitotic in gran parte durante lo sviluppo prenatale, e quindi mantenere la loro nuclei per tutta la durata della vita piena. Tuttavia, poco si sa sui cambiamenti neuronali e organizzazione della cromatina nucleare durante il corso dello sviluppo e dell&#39;invecchiamento, o in malattie croniche neuropsichiatrici. Tuttavia, ad oggi i test basati la maggior parte della cromatina e DNA (esclusi quelli di pesci) risoluzione mancanza singola cellula. A tal fine, la notevole eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa, perché di solito diverse sottopopolazioni di neuroni sono mescolati con diversi tipi di cellule gliali e di altre cellule non neuronali. Una possibile soluzione sarebbe far crescere specifiche culture di cellule-tipo, ma la maggior parte delle cellule del SNC, tra cui i neuroni, sono ex vivo sostenibile, nella migliore delle ipotesi, solo per poche settimane e quindi avrebbe fornito un modello incompleto per meccanismi epigenetici potenzialmente operanti in tutto il ciclo di vita completo . Ecco, mettiamo a disposizione un protocollo per estrarre e purificare i nuclei da congelati (non fisso) del cervello umano post-mortem. Il metodo prevede l&#39;estrazione dei nuclei in tampone di lisi ipotonica, seguita da ultracentrifugazione e immunotagging con anticorpi anti-NeuN. Etichettati nuclei neuronali vengono poi raccolti separatamente utilizzando la fluorescenza-attivato ordinamento. Questo metodo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi regione del cervello in una vasta gamma di specie e adatto per gli studi di immunoprecipitazione della cromatina con il sito-specifici e modifica-anticorpi anti-istoni, e per la metilazione del DNA ed altri test.

L&#39;eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

I neuroni del cervello umano diventano postmitotici in gran parte durante lo sviluppo prenatale e, di conseguenza, mantengono i loro nuclei per l'intera durata della vita. Tuttavia, ...

Per studiare le interazioni tra cromatina e DNA che regolano l'espressione genica specifica dei neuroni nel cervello umano, è necessario innanzitutto ottenere una popolazione pura di nuclei neuronali. Il tessuto cerebrale umano post mortem viene omogeneizzato e i nuclei totali sono isolati mediante centrifugazione in gradiente di densità. Successivamente, i nuclei vengono marcati con anticorpi specifici per i neuroni e isolati tramite sorting in citometria a flusso, per poi essere infine concentrati mediante ultracentrifugazione.Ciao, sono Anish Matan del laboratorio della dottoressa Sharon mc Barian, presso il dipartimento di psichiatria della University of Massachusetts Medical School. Oggi vi mostrerò una procedura per l'isolamento di nuclei neuronali da tessuto cerebrale umano post mortem. Cominciamo.Per ogni campione di nuclei da separare, partire da mille milligrammi di tessuto cerebrale post mortem congelato. Con questa quantità, è possibile ottenere circa 5 milioni di nuclei neuronali dopo la separazione attivata da fluorescenza. Per iniziare l'estrazione dei nuclei, inserire 250 milligrammi di tessuto cerebrale in un douncer contenente cinque millilitri di buffer di lisi e

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo un processo che utilizza laser-capture microdissezione per isolare ed estrarre l'RNA da una popolazione omogenea di cellule, neuroni piramidali, nello strato III del giro temporale superiore nel cervello umano post-mortem. Successivamente abbiamo linearmente amplificare (T7-based) mRNA, e ibridare il campione umano X3P microarray Affymetrix.

L&#39;ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

Nuclei cardiaca sono isolati tramite sedimentazione densità e immunolabeled con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) per identificare e ordinare nuclei cardiomiociti mediante citometria a flusso.

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Questo video descrive il protocollo per isolare singoli nuclei da un tessuto di glioma fresco congelato. I singoli nuclei isolati possono essere utilizzati come campioni per tecniche di sequenziamento come il sequenziamento di RNA a singoli nuclei (snRNA) e il saggio a singolo nucleo per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATAC) per ottenere informazioni più approfondite sull'eterogeneità inter- e intra-tumorale osservata nel glioma dei tessuti nervosi centrali.

Isolamento di nuclei da tessuti di glioma freschi congelati: un metodo per ottenere nuclei intatti da campioni di tumore di glioma

Il video mostra un metodo per isolare nuclei intatti da cellule gliali e staminali nel giro dentato (DG) dell'ippocampo di topo. Il tessuto DG viene dissociato meccanicamente in un tampone di omogeneizzazione freddo per rilasciare i nuclei. I detriti tissutali e gli altri organelli rilasciati vengono scartati e i nuclei vengono colorati con una colorazione del DNA e un anticorpo coniugato con fluorofori specifico per l'antigene nucleare neuronale (NeuN). Lo smistamento dei nuclei attivati dalla...

Una tecnica per isolare nuclei da cellule non neuronali nel giro dentato dell'ippocampo

Questo video mostra la procedura per isolare e smistare i nuclei da tessuto cerebrale umano appena congelato utilizzando la selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS), che consente lo studio di diverse popolazioni cellulari per varie applicazioni neurologiche.

Isolamento di popolazioni cellulari dal tessuto cerebrale mediante smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza

L'eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Lo studio descrive un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per isolare nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei a valle.

Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei

Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.

Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Scopri come isolare nuclei neuronali da tessuto cerebrale umano postmortem per studiare le interazioni cromatiniche e l'espressione genica specifica. Questo protocollo migliora la risoluzione nelle ricerche epigenetiche.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Esplora altri video