Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Al fine di studiare le interazioni del DNA della cromatina che governano l'espressione genica neuronale specifica nel cervello umano, è necessario prima ottenere una popolazione pura di nuclei neuronali. Il tessuto cerebrale umano post-mortem viene omogeneizzato e i nuclei totali vengono isolati utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità. Quindi i nuclei vengono marcati con anticorpi neuronali specifici isolati tramite smistamento metrico a flusso e infine concentrati con ultracentrifugazione.

Ciao, sono Anish Matan del laboratorio della dottoressa Sharon mc Barian qui nel dipartimento di psichiatria della University of Massachusetts Medical School. Oggi vi mostrerò una procedura per l'isolamento dei nuclei neuronali dal tessuto cerebrale umano post mortem. Quindi iniziamo.

Per ogni campione di nuclei da ordinare, inizia con mille milligrammi di tessuto cerebrale postmortale congelato. Con questa quantità, è possibile ottenere circa 5 milioni di nuclei neuronali dopo lo smistamento attivato dalla fluorescenza. Per iniziare l'estrazione dei nuclei, metti 250 milligrammi di tessuto cerebrale in un piumino contenente cinque mil di tampone di lisi e mettilo sul ghiaccio.

Una volta che il fazzoletto si scongela per un minuto mentre è in ghiaccio. Dopo l'abbassamento, trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta per ultracentrifuga trasparente da 15 mil e quindi mettere la provetta sul ghiaccio. Ripetere questa omogeneizzazione per il tessuto rimanente.

Quindi, pipettare con cura nove mil di soluzione di saccarosio sul fondo delle provette dell'ultracentrifuga per impostare un gradiente di concentrazione tale che la soluzione tissutale omogeneizzata si trovi sopra la soluzione di saccarosio. Ora pesare le provette dell'ultracentrifuga per assicurarsi che siano bilanciate durante l'ultracentrifugazione. Apportare eventuali regolazioni al peso aggiungendo un tampone di lisi allo strato superiore Dopo che le provette sono state pesate, posizionarle nell'ultracentrifuga utilizzando i campioni di ultracentrifuga a rotore SW 28 a 107163.6 RCF per 2,5 ore a quattro gradi.

Una volta completata la centrifugazione, aspirare la fetta e lo strato di detriti che si trova al gradiente di concentrazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet sul fondo del tubo, che contiene i nuclei. Quindi, aggiungi 500 microlitri di un XPBS a ciascun pellet e lascialo riposare sul ghiaccio per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, sospendere nuovamente i pellet pipettandoli su e giù. L'incubazione su ghiaccio consente ai pellet di dissolversi un po' da soli, il che rende più facile la risospensione dei nuclei, diminuendo così la quantità di stress che i nuclei subiscono. Quindi trasferire la sospensione di resus e i nuclei in due provette da centrifuga mil.

Combinare la soluzione nucleica di due delle provette ultra centrifiche a ciascuna provetta micro centrifi e, di nuovo, posizionare i campioni sul ghiaccio. Ora che l'estrazione nucleica è completa, passerò alla fase di immunocolorazione per isolare i nuclei neuronali infatti, lo smistamento del campione contenente i nuclei sarà incubato con una miscela di immunocolorazione composta da anticorpi primari e secondari, oltre a bloccare i collegamenti per rendere la miscela di immunocolorazione a 1,2 microlitri di anticorpo specifico neuronale nuovo N a 300 microlitri di un XPBS. Quindi aggiungere un centinaio di microlitri di miscela bloccante, che contiene lo 0,5% di BS, A e il 10% di siero a codice normale in un XPBS.

Infine, aggiungere un microlitro dell'anticorpo secondario chiamato LOR 4 88. Preparare anche un colorante immuno per un campione di controllo negativo per questa miscela di coloranti immunologici. Escludere l'anticorpo primario new end e sostituirlo con 1,2 microlitri di un XPBS.

Ora agitare le miscele di immunocolorazione e incubarle per cinque minuti a temperatura ambiente al buio mentre le miscele di colorazione sono in incubazione. Preparare i campioni di nuclei di controllo per il campione di controllo negativo Eloqua 20 microlitri di resus span nuclei in una provetta da due mil contenente 980 microlitri di un XPBS. Preparare anche un controllo non colorato, che contenga solo la soluzione di nuclei e PBS.

Ora Eloqua 20 microlitri di nuclei in un altro tubo e aumentare il volume fino a un mil con un XPBS. Quindi rimettere tutti i campioni sul ghiaccio. A questo punto le miscele immunocoloranti sono finite.

Durante l'incubazione, aggiungere 401 microlitri della miscela nel campione appropriato. Il campione di nuclei ha ricevuto la miscela contenente sia nuovo che LOR 4 88. Il campione di controllo negativo ha ricevuto una miscela contenente solo l'anticorpo secondario LOR 4 88, mentre al campione di controllo non colorato non viene aggiunto alcun colorante immuno.

Quindi, trasferire i campioni nel coldron e ruotarli al buio per 45 minuti. Ora che l'incubazione di 45 minuti è completa, accompagnerò i campioni alla struttura centrale di citometria a flusso della University of Massachusetts Medical School per eseguire un po' di smistamento attivato dalla fluorescenza Durante il trasporto alla struttura centrale, i campioni devono essere conservati su ghiaccio e al buio. Presso la struttura centrale della citometria a flusso, i campioni vengono prima filtrati attraverso un filtro da 40 micron e poi fatti passare attraverso lo strumento per alcuni minuti mantenendo il freddo.

Questo viene fatto per ottenere alcuni dati preliminari prima dell'ordinamento. Il controllo non colorato stabilisce il grado di fluorescenza negativa. Sulla base di queste informazioni, regolare la sensibilità della macchina alla fluorescenza.

Il controllo colorato viene utilizzato per controllare l'influenza. Eventuali rumori di fondo dovuti alla mancanza di fluorescenza, a questo punto impostare i cancelli appropriati necessari per lo smistamento. Diversi cancelli vengono utilizzati per smistare i campioni.

Ecco alcuni dati tipici per il primo cancello. Questo grafico di analisi fax mostra un campione rappresentativo dopo che il cancello è stato regolato. Il primo cancello riconosce i modelli di detriti e i nuclei vitali in base a una combinazione di impostazioni come la fluorescenza e l'esperienza visiva generale.

L'asse x rappresenta la dispersione in avanti, che corrisponde alla dimensione relativa, mentre l'asse Y rappresenta la dispersione del sito, che rappresenta la complessità interna come la granularità. Il primo cancello può anche dare un'idea delle dimensioni dei diversi nuclei trovati all'interno del nostro campione. Questo permette di separare i detriti dai nuclei veri e propri, ed ecco alcuni dati tipici del secondo cancello.

Questo grafico fax mostra un esempio di un secondo cancello, che consente di smistare i nuclei singolarmente scartando eventuali aggregati. Questo gate esamina le differenze nella lunghezza del tempo che i nuclei impiegano per passare attraverso il laser. Quelli che sono aggregati normalmente impiegano più tempo per passare.

Questo particolare parametro è molto importante in quanto l'inclusione di aggregati può interferire con la purezza poiché alcuni nuclei fluorescenti possono essere legati a quelli non fluorescenti. Infine, ecco i dati tipici del terzo cancello. Questo gate è impostato su una specifica lunghezza d'onda di fluorescenza che corrisponde a quella del fluorone presente nel nostro anticorpo secondario.

In questo grafico fax, si vede il livello di fluorescenza lungo l'asse x e un rivelatore a canale rosso intenso, PECY sette lungo l'asse Y. Queste macchie di punti offrono una visione migliore se semplicemente confrontate con un istogramma a un singolo colore. Il posizionamento di SCADA consente di ordinare e separare nuclei neuronali nuovi e positivi da nuclei non neuronali nuovi e negativi.

Dopo che tutte le porte sono state scelte, i nuclei vengono ordinati in un XPBS. Una volta che l'intero campione è passato attraverso l'ordinamento dei fatti, verificare la purezza dell'ordinamento facendo passare un Eloqua del campione ordinato attraverso lo strumento. Ecco un esempio di risultato ottimale.

Qui confronta il campione di prelocalità, che contiene una popolazione mista dei nuclei, con l'Eloqua selezionato che ha eliminato la maggior parte dei nuclei negativi. Si noti che le percentuali di purezza si basano sul numero di eventi che contaminano il campione in base ai gate impostati. Tenere presente che la prima volta che il campione viene fatto passare attraverso la macchina, potrebbe verificarsi uno sbiancamento, causando così un certo oscuramento per tenere conto di ciò, potrebbe essere necessario apportare alcune regolazioni.

Una volta che il campione è stato selezionato, iniziare a elaborare i nuclei. Per fare ciò, prelevare 10 mil del campione selezionato e aggiungere due mil di soluzione di saccarosio, 50 microlitri di cloruro di calcio molare e 30 microlitri di acetato di magnesio molare. Se ci sono meno di 10 mil di campione selezionato, aumentare il volume fino a 10 mil aggiungendo un XPBS o regolare i materiali aggiuntivi di conseguenza.

Quindi, capovolgere il campione più volte e metterlo sul ghiaccio per 15 minuti. Dopo 15 minuti, campione di caratteristica centrale in un rotore a secchiello oscillante 1, 786 RCF per 15 minuti a quattro gradi. Dopo la centrifugazione, aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet bianco che si trova sul fondo della provetta.

Quindi sciogliere il pellet in 200 microlitri della soluzione appropriata necessaria per gli esperimenti precedenti. In questo caso, stiamo sciogliendo il pellet e il tampone di abbattimento per il successivo esperimento del chip. Quindi risospendere il pellet con un tubo su e giù.

A questo punto, puoi trasferire i nuclei in un tubo più piccolo e metterlo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Fino a nuovo utilizzo, beh, vi ho appena mostrato come isolare i nuclei neuronali dal tessuto cerebrale umano post-mortem. Con questi nuclei, è possibile eseguire una serie di analisi diverse come l'immunoprecipitazione della cromatina.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di tenere sempre i campioni sul ghiaccio poiché i pannelli nucleari non sono fissati e possono degradarsi a lunga temperatura. Inoltre, è importante maneggiare i tessuti umani con standard di sicurezza di livello di biosicurezza due o superiori. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.