Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

Nel laboratorio Dowling, studiamo la fisiologia e lo sviluppo della retina nei pesci zebra per determinare se i mutanti di pesce zebra incapaci di rilevare il movimento possano comunque rilevare la luce e non siano completamente ciechi. Per fare ciò, testiamo la loro risposta motoria visiva, o VMR. Raccogliamo i pesci zebra a circa quattro giorni dalla fecondazione.

Posizionarli in piastre a 96 pozzetti, preparare un apparato adatto per l'acquisizione delle immagini, allineare il software di tracciamento video con la piastra e quindi registrare la risposta motoria dei pesci dopo il passaggio da luce a buio o da buio a luce, fenomeno che chiamiamo VMR. Ciao, sono Farida Imran del laboratorio di John Dowling e del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Harvard.

E io sono Jason Rio. Provenio dal laboratorio di Alexander Shear, anch'esso nel dipartimento di biologia molecolare e cellulare dell'Università di Harvard. Oggi vi mostreremo la risposta motoria visiva nel pesce zebra a incrementi e decrementi di luce.

Iniziamo. Per eseguire il saggio della risposta motoria visiva, coltivare prima larve di zebrafish di tipo selvatico in un ciclo luce-buio a 28 gradi Celsius fino a almeno quattro giorni dopo la fecondazione. Il nostro ciclo luce-buio tipico prevede 14 ore di luce accesa a partire dalle 9:00 e 10 ore di buio a partire dalle 23:00 per ottenere i migliori risultati comportamentali.

Evitare l'eccessivo affollamento delle larve. Di solito manteniamo non più di 50 larve in una singola piastra di Petri. Dopo cinque giorni dalla fecondazione, trasferiamo i pesci zebra in una piastra a 96 pozzetti con una capacità di 650 microlitri per pozzetto, in modo da fornire alle larve un ampio spazio per nuotare.

Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire delicatamente un singolo larva per pozzetta. Dopo aver trasferito i pesci nelle pozzette, riempire ogni pozzetta con acqua per pesci in quantità sufficiente affinché la superficie dell'acqua sia quasi allineata al bordo superiore delle pozzette. Prestare attenzione a non sovra- o sottoriempiere le pozzette per evitare problemi ottici durante la registrazione con la telecamera.

Prestare inoltre attenzione a non introdurre bolle nelle pozzette. I pesci sono ora pronti per essere monitorati per le loro risposte locomotorie alla luce e al buio. Portiamo i pesci zebra in piastra all'apparato di registrazione.

Procediamo dunque esaminando l'apparato di registrazione. La piastra a 96 pozzetti contenente i pesci verrà posizionata all'interno della camera di registrazione, in questo vassoio bianco, e fissata con una molla o un elastico. La telecamera è posizionata nella parte posteriore della scatola ed è focalizzata sulla piastra mediante specchi situati sulla parte superiore della scatola, qui.

L'angolo di questi specchi può essere regolato ruotando le viti che fissano gli specchi in posizione. La camera di registrazione è illuminata dal basso mediante LED a infrarossi. Ciò consente alla telecamera di registrare i pesci anche al buio.

I larve non sono in grado di rilevare la luce IR, quindi questa illuminazione costante a infrarossi non influenza l'esperimento. I LED bianchi illuminano anche la camera di registrazione dal basso. Sono controllati separatamente rispetto alle luci IR per esperimenti che durano più di alcune ore.

La camera può essere riempita con acqua in lieve movimento per aiutare a mantenere una temperatura costante durante l'esperimento. L'acqua viene pompata da un serbatoio tramite una piccola pompa per acquari ed è riscaldata a 28 gradi mediante un comune riscaldatore subacqueo per acquari. L'acqua defluisce attraverso un foro di scarico di grandi dimensioni e viene ricircolata nel serbatoio per ridurre al minimo le vibrazioni estranee provenienti dall'ambiente.

L'intera unità di registrazione è posizionata su un tavolo antivibrante pesante. Quando l'apparato di registrazione è pronto, un coperchio della scatola viene utilizzato per coprire gli animali e isolarli ulteriormente dalla luce. Procediamo ora con l'allineamento del 96.

Piastra a pozzetti con la griglia del software di tracciamento video già impostata; posizionare per prima cosa la piastra a 96 pozzetti contenente i pesci nella camera di registrazione. Quando si utilizza un bagnomaria per esperimenti a lungo termine, inserire lentamente la piastra nell'acqua, consentendo al livello dell'acqua di adattarsi senza fuoriuscire sulla piastra. Nel software di tracciamento video, verificare che tutti i larvi e l'esperimento siano visibili sullo schermo del computer.

Utilizzando i controlli del software, allineare la griglia del software di video tracciamento con le pozzette della piastra a 96 pozzette in modo che ciascun pesce si trovi all'interno di un quadrato della griglia. Questo passaggio è molto importante per tutte le registrazioni. Il computer di tracciamento calcolerà il movimento separatamente per ciascuna di queste caselle.

Quindi, se si allinea in modo errato la griglia del computer, alcuni movimenti dei pesci potrebbero andare perduti o, peggio ancora, due pesci adiacenti potrebbero occupare la stessa area e venire conteggiati come un unico pesce dopo l'allineamento. Il momento in cui le luci si accenderanno e spegneranno è programmato nel computer.

Di solito consentiamo tre ore di adattamento al buio più leggero all'interno della scatola. Questo non solo permette di ottenere un livello di attività di base, ma offre anche alle larve l'opportunità di calmarsi dopo la pipettaggio e la manipolazione. Successivamente, chiudiamo la porta della camera di registrazione e iniziamo la registrazione.

In pratica, registriamo l'attività di ciascun pesce ogni secondo, ma il software di rilevamento registra effettivamente i dati fotogramma per fotogramma. Qui sotto lo schermo è possibile osservare un tracciato in tempo reale di un singolo pesce. In termini di movimento in pixel, la linea bianca indica che il numero di cambiamenti di pixel è inferiore a una soglia prestabilita, mentre il verde indica che il cambiamento di pixel è superiore alla soglia impostata.

Il valore della soglia dipenderà in una certa misura dalla specifica fotocamera e dall'illuminazione utilizzata. Per il nostro apparato, utilizziamo tipicamente una soglia di quattro pixel. Cioè, se cambiano meno di quattro pixel, ciò viene considerato rumore di fondo.

Se si muovono più di quattro pixel, ciò indica che il pesce si sta spostando. Abbiamo stabilito empiricamente che questa soglia rileva quasi tutti i movimenti natatori e di virata delle larve. Anche se le aree di registrazione isolano abbastanza bene le larve, spegniamo comunque la luce nella stanza e adottiamo accorgimenti per ridurre al minimo le interruzioni causate da rumori meccanici, come l'apertura e la chiusura delle porte, fare una festa danzante o svolgere i nostri esercizi fisici.

Al termine dell'esperimento, trasferire i dati raccolti in un foglio Excel o nel software di analisi preferito. Questo è l'aspetto dei dati, che contengono il tempo in secondi dall'inizio dell'esperimento e l'attività di ciascun larva al secondo.

Di seguito è riportato un grafico che mostra l'attività di una singola larva per tutta la durata dell'esperimento, con diverse risposte di accensione e spegnimento indicate dalle frecce sul grafico. Questo grafico mostra l'attività media di 40 pesci per tutta la durata dell'esperimento, con diverse risposte di accensione e spegnimento indicate dalle frecce. Come si può osservare, le risposte di accensione e spegnimento sono evidenti e costanti.

Questo esperimento sulla risposta motoria visiva può essere eseguito anche su pesci mutanti. Per questi studi, di solito si seminano pesci selvatici e pesci mutanti sulla stessa piastra, disponendoli in un modello a scacchiera per ottimizzare i controlli. Quando si utilizzano pesci mutanti sulla stessa piastra dei pesci selvatici, assicurarsi di annotare il tipo di pesce seminato in ciascun pozzetto.

Ecco un suggerimento su come tenere traccia dei pesci posizionati in ciascun pozzetto. Ecco i risultati della risposta motoria visiva, che confrontano larve di tipo selvatico e larve mutate. Ancora una volta, osserviamo risposte di accensione e spegnimento marcate e coerenti nelle larve di tipo selvatico.

Tuttavia, le larve del ceppo mutante chalk, che non sviluppano gli occhi, non aumentano significativamente la loro attività né in risposta a incrementi né a decrementi di luce e presentano un livello basale di attività ridotto. Questi risultati confrontano le risposte del tipo selvatico con quelle dei mutanti NO OKR, chiamati anche mutanti NRC. Si riteneva che il mutante NRC fosse completamente cieco in base al test OKR.

Utilizzando il test di risposta motoria visiva, dimostriamo che il mutante NRC presenta una risposta allo spegnimento normale e una risposta all'accensione ritardata e lenta. Pertanto, il mutante NRC non è completamente cieco, come si riteneva in precedenza. Abbiamo appena mostrato la risposta motoria visiva del pesce zebra labate agli incrementi e decrementi di luce.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di effettuare l'esperimento durante il giorno, poiché i pesci sono più attivi e reattivi ai cambiamenti dell'intensità luminosa di giorno rispetto alla notte. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.