Name: Immunoprecipitazione DNA metilato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Scopri il protocollo MeDIP per isolare DNA metilato in modo imparziale usando anticorpi anti-5-metilcitosina. Questa tecnica epigenetica rivela pattern di metilazione fondamentali per lo sviluppo e le malattie.

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Desideriamo ringraziare i membri della Brown e laboratori Lam per la loro partecipazione criticare questo video e articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute e la Michael Smith Fondazione per la Ricerca Sanitaria.

DNA ESTRAZIONE E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DNA da una varietà di diversi campioni (cellule in coltura, fresco congelato così come i tessuti fissati in formalina paraffina) può essere utilizzato per MeDIP. E &#39;importante utilizzare il DNA altamente purificato, senza proteine ​​associate come gli istoni. E &#39;anche importante rimuovere l&#39;RNA il più possibile dal campione, in quanto può interferire sia con la quantificazione del DNA e legame degli anticorpi. La quantità di DNA utilizzata per MeDIP può variare da 200 ng a 1 mg a seconda della quantità di DNA disponibile. Per dimostrare questo protocollo, 1 mg di DNA verrà utilizzato. Il seguente protocollo fornirà alta qualità DNA a doppia elica da cellule in coltura. Altri protocolli dovrebbero essere impiegati per l&#39;estrazione del DNA altri tipi di campioni. <ol><li> Aggiungere 400 ml di buffer di digestione di un pellet di cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf. </li><li> Aggiungere 100 mg di proteinasi K al tubo, e incubare una notte a 50 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri fenolo pH 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando. </li><li> Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta. </li><li> Ripetere i passaggi da 3 a 5 una volta. </li><li> Aggiungere 500 microlitri 01:01 pH fenolo / cloroformio 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando. </li><li> Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 40 mg di RNasi A e incubare 1 ora a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri fenolo pH 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando. </li><li> Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta. </li><li> Ripetere i passaggi da 11 a 13 una volta. </li><li> Aggiungere 500 microlitri 01:01 pH fenolo / cloroformio 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando. </li><li> Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta. </li><li> Aggiunta del volume 1/10th 3 acetato di sodio M (40 mL) e mescolare bene. </li><li> Aggiungere 2 volumi (900 microlitri) del 100% di etanolo, mescolare bene, e posto a -20 ° C per 20 minuti. </li><li> Girano a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare l&#39;etanolo, rotazione del polso, ed eliminare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% da lavare. Girano a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere etanolo al 70%, rotazione del polso, ed eliminare l&#39;etanolo residuo pipettando. </li><li> Aria secca il pellet con il tappo aperto per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere ogni traccia di etanolo residuo. </li><li> DNA Risospendere in 50 ml di dH2O sterilizzato notte a 4 ° C. </li><li> Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Un A 260: A 280 rapporto di 1,8 è l&#39;ideale. </li><li> Determinare la qualità e le dimensioni del DNA su un gel di agarosio con 100 bp scaletta. Meno di 10 ng di DNA genomico può essere eseguito su un 1,7% gel seguita dalla colorazione con un colorante che è molto sensibile a piccole quantità di DNA come oro SYBR. </li><li> In un tubo siliconato per campione, preparare 1 mg di DNA in un volume totale di 50 microlitri con il resto del volume composto sterilizzato con dH 2 O. </li></ol> DNA sonicazione Sonicazione del DNA e il protocollo MeDIP deve essere effettuata in tubi siliconzied a prevenire le non legame specifico delle proteine ​​alle pareti del tubo. Tempi di sonicazione ottimale per i campioni di DNA sono in base al grado di frammentazione del DNA campione determinato da elettroforesi su gel (Punto 27). Per esempio, il DNA estratto dalle cellule in coltura dovrebbero essere di altissimo peso molecolare, e dovranno successivamente essere più sonicazione di DNA estratto da campioni di archivio che sono spesso parzialmente degradate. Se i campioni sono uniformemente alto peso molecolare, è ragionevole a questo punto per procedere con la sonicazione, come descritto in questo protocollo senza controllare ogni campione singolarmente. Se i campioni sono frammentati, come con i campioni d&#39;archivio, sarà necessario adeguare la procedura di sonicazione probabilmente diminuendo i tempi sonicazione di ottenere 300-100bp frammenti. Se si prevede di trattare i campioni che sono parzialmente degradate, l&#39;ottimizzazione dei parametri di sonicazione può essere eseguita su un campione rappresentativo di quelli di interesse. Sulla base del grado di frammentazione del DNA osservata da elettroforesi su gel (Step 27), lo sperimentatore può predeterminare il momento ottimale per sonicazione del campione. Qui si descrive un metodo per ottenere frammenti di DNA 300-1000 bp mediante ultrasuoni con un dispositivo automatico sonicating (Bioruptor da Diagenode, UCD-200 TM) con alto peso molecolare del DNA. <ol><li> Acqua in Biorupter deve essere a 4 ° C. </li><li> Ultrasuoni per 7 minuti a impostazioni automatiche (30 sec a 30 sec fino alla potenza massima). </li><li> Rimuovere 800 ng (40 microlitri) di prodotto sonicato e mettere in provetta da centrifuga siliconato 1,7 ml per la immunoprecipitazione (IP) di reazione. </li><li> Mettere da parte restanti 200 ng (10 microlitri) per servire come input (IN) del DNA di riferimento (conservare a 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON di DNA metilato <ol><li> Denaturare il DNA che verrà utilizzato per la reazione IP (800 ng) a 95 ° C per 10 minuti in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Raffreddare immediatamente in ghiaccio. Lasciate raffreddare completamente il DNA (circa 5 minuti in ghiaccio) prima di procedere con il passo successivo. </li><li> Aggiungere 5 anticorpo monoclonale mcg. </li><li> Aggiungi tampone IP (usato a temperatura ambiente per tutto questo protocollo) per un volume finale di 500 microlitri. </li><li> Incubare per 2 ore a 4 ° C in rotazione titolare tubo. </li><li> Poco prima fase 5 è completa, preparare Dynabeads di lavaggio (Piazza di 6-11). In primo luogo, risospendere le sfere completamente nel flacone con il vortex. </li><li> Trasferire il 30 microlitri (~ 2 x 10 7) di Dynabeads risospeso per reazione più 1, in un nuovo tubo siliconato (per esempio, se facendo 8 reazioni, rimuovere numero sufficiente di sfere per 9, cioè 270 microlitri). </li><li> Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipetta il sopranatante. Quando si rimuove il surnatante, evitare di toccare le perline contro parete interna (dove le perle attrarre verso il magnete) con la punta della pipetta. </li><li> Togliere la provetta dal magnete, e risospendere le sfere in un volume in eccesso di tampone IP (750 microlitri-1000 microlitri). Posizionare il tubo di nuovo sul sostegno magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere il lavaggio una volta di più, e poi risospendere le sfere lavato in tampone IP nel volume originale rimossa al punto 7. </li><li> Aggiungere 30 ml di Dynabeads lavata per ogni reazione IP </li><li> Incubare in un tubo di supporto rotante per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione è completa, posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipetta il sopranatante. Evitare di toccare la parete interna del tubo (dove le perle attrarre verso il magnete) con la punta della pipetta. Aggiungere 500 ml di tampone IP. Mescolare il contenuto della provetta e rimetterlo sul sostegno magnetico per 2 minuti. Ripetere il lavaggio con 500 IP Buffer ul una sola volta. </li><li> Dopo aver rimosso il sopranatante l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 400 ml di buffer di digestione. </li><li> Trattare la reazione con 100 mg di proteinasi K e incubare una notte a 50 ° C. </li></ol> Purificazione del DNA immunoprecipitato <ol><li> Aggiungere 500 microlitri 01:01 pH fenolo / cloroformio 7 e vortice accuratamente. </li><li> Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta. </li><li> Ripetere i passaggi da 1 a 3 se l&#39;interfase tra gli strati acquosi e organici aspetto torbido. </li><li> Aggiungere 1 / 10 ° volume di 3 M di acetato di sodio (40 microlitri) e vortice. </li><li> Aggiungere 1 ml di glicogeno (20 mg / mL) e vortice. </li><li> Aggiungere 2 volumi (1000 ml) del 100% di etanolo, vortice, e posto a -20 ° C per 20 minuti. </li><li> Girano a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare l&#39;etanolo, rotazione del polso, ed eliminare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% da lavare. Vortex brevemente, e far girare a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere etanolo al 70%, rotazione del polso, ed eliminare l&#39;etanolo residuo pipettando. </li><li> Aria secca il pellet con il tappo aperto per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere ogni traccia di etanolo residuo. </li><li> Risospendere DNA pellet in 10 microlitri sterilizzati dH 2 0. </li></ol> Convalida da parte della PCR <ol><li> Si può verificare per assicurarsi che la procedura sta funzionando MeDIP eseguendo il protocollo MeDIP utilizzando normale DNA umano (maschio o femmina), e successivamente analizzando una regione nota per essere arricchito per metilazione. </li><li> Rimuovere il 30% del prodotto MeDIP al tubo PCR, e un altro 30% del prodotto MeDIP ad un altro tubo di PCR. </li><li> Mettete 10 ng di IN DNA in un tubo di PCR, e 10 ng di IN DNA in un altro tubo PCR. Si dovrebbe ora avere quattro reazioni separate PCR da configurare. </li><li> Eseguire la PCR con H19 e CTRL primer come indicato nella Tabella 1. </li><li> Preparare due mastermixes (uno per ogni set di primer) per le reazioni di PCR con 12,5 microlitri di volume totale come indicato nella Tabella 2. </li><li> Thermocycle la PCR utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 3. </li><li> Esegui 5 ml di prodotti di PCR su un gel di agarosio al 2% per la visualizzazione. </li><li> I risultati attesi per MeDIP successo sono riportati nella tabella 4. </li></ol> Tabelle Tabella 1: H19 e CTRL primer per la validazione della PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Set di primer </td><td> Primer avanti </td><td> Primer reverse </td><td> Formato del prodotto atteso </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (controllo) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Mastermixes per le reazioni PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (per RXN) </td><td> CTRL Mix (per RXN) </td></tr><tr><td&gt; DDH 2 O </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> Buffer 10X </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mm ciascuno) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Primer (H19_F / R o CTRL_F / R) (10 mM ciascuno F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. PCR thermocyling condizioni. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Risultati attesi PCR per MeDIP successo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Modello di DNA </td></tr><tr><td> Primer utilizzati </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positivo </td><td> Positivo </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positivo </td><td> Negativo </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
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<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
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<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Vi è una crescente consapevolezza della metilazione del DNA gioca significativo ruolo nella malattia, quindi lo sviluppo di test per misurare questa modifica sono sempre più importanti 3, 12, 13. La tecnica MeDIP è uno strumento suscettibile di screening, sia l&#39;intero genoma e locus specifico livello 6, 7. Questa tecnica fornisce una visione rapida dei livelli di metilazione del DNA utilizzando quantità limitate di partenza del DNA e permette un facile confronto tra le diverse fonti. Applicazio...

<table><tbody><tr><td>Sonicatore Biorupter</td><td>Strumento</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>Provette microcentrifuga SafeSeal da 1,7 ml</td><td>Altro</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometro ND 3300</td><td>Strumento</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario: Anti-5&amp;rsquo;-metilcitosina mouse mAb</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Portaprovette magnetico</td><td>Strumento</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Strumento</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>Buffer per IP</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Buffer di digestione</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

immunoprecipitazione dna metilato

Methylated DNA Immunoprecipitation

L&#39;identificazione di modelli di metilazione del DNA è una procedura comune nello studio dell&#39;epigenetica, come metilazione è conosciuto per avere effetti significativi sulla espressione genica, ed è impegnato con il normale sviluppo così come la malattia<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Così, la capacità di discriminare tra il DNA metilato e non metilato del DNA è essenziale per la generazione di profili di metilazione per tali studi. DNA metilato immunoprecipitazione (MeDIP) è una tecnica efficace per l&#39;estrazione del DNA metilato da un campione di interesse<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Un campione di appena 200 ng di DNA è sufficiente per l&#39;anticorpo, o immunoprecipitazione (IP), reazione. Il DNA è sonicato in frammenti di dimensioni variabili da 300-1000 bp, ed è diviso in immunoprecipitati (IP) e ingresso (IN) porzioni. DNA IP viene successivamente calore denaturato e poi incubate con anti-5&#39;mC, permettendo l&#39;anticorpo monoclonale di legare il DNA metilato. Dopo questo, sfere magnetiche che contiene un anticorpo secondario con affinità per l&#39;anticorpo primario sono aggiunti, e si incuba. Queste perline legati anticorpi si legano l&#39;anticorpo monoclonale utilizzato nella prima fase. DNA legato al complesso anticorpale (DNA metilato) è separata dal resto del DNA, utilizzando un magnete per tirare i complessi in soluzione. Numerosi lavaggi utilizzando tampone IP vengono poi eseguite per rimuovere l&#39;, non legato non metilato DNA. La metilazione del DNA / anticorpo vengono digeriti con proteinasi K per digerire gli anticorpi lasciando solo il DNA metilato intatto. Il DNA purificato è arricchito da fenolo: estrazione con cloroformio per rimuovere la questione delle proteine ​​e poi precipitare e risospeso in acqua per un uso successivo. Tecniche di PCR può essere utilizzato per convalidare l&#39;efficienza della procedura MeDIP analizzando i prodotti di amplificazione del DNA IN IP e per le regioni noti per mancanza e noti per contenere sequenze metilate. Il DNA purificato metilato può quindi essere utilizzata per locus-specifici (PCR) o genome-wide (microarray e sequenziamento) studi di metilazione, ed è particolarmente utile quando applicato in combinazione con altri strumenti di ricerca quali profili di espressione genica e l&#39;ibridazione genomica comparativa serie ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Ulteriori indagini in metilazione del DNA porterà alla scoperta di nuovi bersagli epigenetici, che a sua volta, può essere utile per lo sviluppo di nuovi strumenti di ricerca terapeutica o prognostici per malattie come il cancro che sono caratterizzati da metilazione aberrante del DNA<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Immunoprecipitazione DNA metilato

L'identificazione dei pattern di metilazione del DNA è una procedura comune nello studio dell'epigenetica, poiché è noto che la metilazione abbia effetti significativi su...

Questo video illustra un protocollo per l'immunoprecipitazione del DNA metilato o MeDIP, un metodo utilizzato per isolare in modo specifico e senza bias il DNA metilato. La metilazione del DNA nei mammiferi è caratterizzata dall'aggiunta di un gruppo metilico alla posizione C5 della citosina.Quando presente in un dinucleotide CPG, costituisce un marcatore epigenetico reversibile che svolge un ruolo importante nello sviluppo normale, nonché in diversi processi patologici. Le funzioni normali della metilazione del DNA includono l'inattivazione del cromosoma X nelle femmine, il silenziamento degli elementi ripetitivi, l'imprinting genomico e il mantenimento della stabilità genomica. È stato inoltre dimostrato che la metilazione del DNA svolge un ruolo in numerose malattie come il cancro, la sindrome di Prader-Willi, la sindrome di ICF (immunodeficienza, instabilità centromerica e sindrome da anomalie facciali) e la sindrome di Rett.Nelle neoplasie, ad esempio, l'ipermetilazione anomala dei promotori può portare al silenziamento di geni fondamentali di soppressione tumorale. Mentre un'ipometilazione inadeguata provoca instabilità cromosomica e attivazione degli oncogeni; l'incontro viene effettuato innanzitutto mediante sonicazione del DNA in frammenti di dimensioni comprese tra 300 e 1000 paia di basi. Il DNA sonificato viene quindi denaturato a 95 gradi Celsius.Si aggiungono anticorpi primari, che riconoscono la cinque prime metazina, e si lasciano legare ai frammenti di DNA metilato. Anticorpi secondari, coniugati a microsferette magnetiche Dyna, vengono utilizzati per isolare i frammenti di DNA legati dall'anticorpo primario. I frammenti non metilati vengono rimossi e gli anticorpi vengono digeriti dalla proteinasi.La pulizia con fenil cloroformio KA rimuove la proteina digerita e la precipitazione purifica il DNA, che ora risulta arricchito in frammenti metilati. Il DNA ottenuto può essere utilizzato per applicazioni come PCR, microarray e sequenziamento. Il procedimento viene generalmente eseguito in due giorni.Il primo giorno prevede la preparazione del DNA, la sonica, l'immunoprecipitazione e la digestione proteica. Il secondo giorno prevede l'estrazione con fenolo-cloroformio e la precipitazione con etanolo per purificare e isolare il DNA arricchito per metilazione. Sono necessari alcuni materiali speciali, tra cui provette centrifuga silanizzate, un dispositivo per la sonica del DNA, un anticorpo primario, anti-5-metilcitosina topo, anticorpo monoclonale, anticorpo secondario, perle Dyna legate a anticorpi anti-IgG di pecora e un portaprovette magnetico.Il primo passaggio del protocollo Meetup è la preparazione del DNA. È fondamentale valutare la natura del DNA in anticipo. È necessario conoscere lo stato del DNA campione, se è principalmente a doppio o a singolo filamento, poiché una quantificazione accurata del campione è di importanza fondamentale e diversi metodi per determinare la quantità di DNA possono essere influenzati negativamente dalla presenza di specie di DNA indesiderate.La quantità di DNA a doppio filamento può essere valutata facilmente mediante fotometria spettrale utilizzando un NanoDrop 3, caricando 1,5 microlitri e impostando il tipo di misurazione su acido nucleico, selezionando DNA 50 come calcolo e inizializzando lo strumento con 1,5 microlitri di acqua. Pulire i piattelli e azzerare lo strumento con 1,5 microlitri del liquido. Il campione viene disciolto, pulire i piattelli, caricare 1,5 microlitri del campione e premere misura.La concentrazione verrà indicata e può essere utilizzata. Per calcolare il numero di microlitri necessari per me, immergere un A due 60 a due 80 con un rapporto di 1,8 è ideale in questo caso. Viene preparato un campione di un microgrammo.Tuttavia, un campione di appena 200 nanogrammi è sufficiente per ottenere risultati soddisfacenti. Per l'analisi, caricare il campione di DNA in una provetta pulita silanizzata. Aggiungere acqua sterile in quantità sufficiente a portare il volume finale a 50 microlitri.La sonicazione del DNA e l'immunoprecipitazione devono essere eseguite in provette silanizzate per prevenire il legame non specifico di DNA e proteine alle pareti delle provette. Una volta che il DNA è stato preparato, il campione deve essere sottoposto a sonicazione, necessaria per frammentare il DNA poiché l'immunoprecipitazione risulta più efficiente con frammenti di DNA più piccoli; caricare il campione nel sonicatore, assicurarsi che l'impostazione della potenza sia al massimo e che la macchina sia impostata su 30 secondi. Dopo 30 secondi di pausa, riempire la base fino al livello indicato con acqua a quattro gradi Celsius.Sonicare il campione per sette minuti. Al termine della sonicazione, rimuovere il tubo e metterlo sul ghiaccio. È importante ottimizzare in anticipo le condizioni di sonicazione in base al campione previsto e alle dimensioni del DNA.Ad esempio, un campione di DNA parzialmente degradato richiederà un tempo di sonica più breve. I prodotti della sonica possono essere visualizzati mediante tecniche elettroforetiche standard. A questo punto, si desiderano frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 300 e 1000 paia di basi per l'uso successivo.Negli saggi con microarray e PCR, si dovrebbe riservare un quinto del DNA come DNA di input o di riferimento; in questo caso, 800 nanogrammi di DNA sonificato verranno utilizzati per l'immunoprecipitazione e il resto sarà conservato come DNA di riferimento. Il passaggio successivo nel protocollo prevede la reazione di immunoprecipitazione (IP); prima dell'aggiunta dell'anticorpo primario, il DNA deve essere denaturato. La denaturazione è necessaria perché l'anticorpo primario riconosce il DNA a singolo filamento.Posizionare il campione in un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine del passaggio di denaturazione, trasferire immediatamente il tubo sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Questo impedirà al DNA denaturato di ripiegarsi nuovamente e permetterà un legame ottimale degli anticorpi una volta che il campione si sarà raffreddato.Centrifugare brevemente il tubo per raccogliere il contenuto sul fondo. Successivamente, va aggiunto l'anticorpo primario. La quantità di anticorpo utilizzata deve essere titolata per ogni lotto e per ogni produttore.In questo caso, aggiungiamo cinque microgrammi di anticorpo primario e quindi aggiungiamo il buffer per immunoprecipitazione o buffer IP fino a un volume finale di 500 microlitri. Successivamente, il DNA per IP viene posto su un agitatore rotante e lasciato incubare a quattro gradi Celsius per due ore. La rotazione è necessaria per evitare la formazione di conglomerati di anticorpi all'interno del tubo durante l'incubazione.Circa 15 minuti prima del completamento dell'incubazione con l'anticorpo primario, pulire e preparare le perle magnetiche Dyna. Innanzitutto, risospendere completamente le perle nel flacone mediante vortex. Successivamente, trasferire 30 microlitri di perle in una provetta pulita silanizzata e posizionare la provetta su un supporto magnetico per le reazioni multiple.Trasferire 30 microlitri di perle per reazione, più una quantità sufficiente per una reazione aggiuntiva per compensare eventuali errori di pipettaggio o perdite accidentali di alcune perle. Ad esempio, per otto reazioni, prelevare un quantitativo di perle corrispondente a nove reazioni, ovvero 270 microlitri.Le perle magnetiche verranno attratte verso la parete del portaprovette magnetico. Attendere due minuti affinché le perle miglino e si depositino in una striscia ben definita sulla parete del tubo. Successivamente, rimuovere e scartare il soprannatante aspirando con attenzione, facendo attenzione a non disturbare le perle sulla parete posteriore con la punta della pipetta.Sostituire il soprannatante con un volume eccessivo di buffer IP, vortexare e riposizionare il campione sul supporto magnetico per due minuti. Ripetere questo lavaggio un’altra volta e risospendere le perle di lavaggio nel loro volume originale di buffer IP. Recuperare il tubo del campione dal rotatore al termine dell'incubazione.Per completare l'immunoprecipitazione, aggiungere 30 microlitri di perle pulite alla reazione e riposizionare il tubo su un rotatore per due ore a quattro gradi Celsius. Durante questa incubazione, l'anticorpo secondario, che è anti topo IgG, si legherà all'anticorpo primario di topo. Gli anticorpi anti topo sono coniugati a perle magnetiche dyna, consentendo un facile recupero dei prodotti legati e il successivo passaggio di purificazione.Al termine dell'incubazione con entrambi gli anticorpi, posizionare il tubo di immunoprecipitazione sul rack magnetico per due minuti. A questo punto, il DNA metilato sarà legato all'anticorpo primario, che a sua volta sarà legato all'anticorpo secondario coniugato con le perle dyna. Rimuovere e scartare il sopranatante e sostituirlo con 500 microlitri di buffer per immunoprecipitazione.Mescolare il contenuto del tubo e riposizionarlo sul rack per due minuti. Ripetere questo lavaggio con il buffer IP un'altra volta. Dopo aver rimosso il soprannatante dall'ultimo lavaggio Resus, sospendere le perline per l'ultima volta.In 400 microlitri di tampone di digestione, trattare la reazione con 100 microgrammi di proteinasi K e incubare tutta la notte a 50 gradi Celsius. Il trattamento con proteinasi K è necessario per digerire le proteine anticorpali e qualsiasi proteina residua associata al DNA, consentendo al DNA metilato di essere rilasciato in soluzione. La purificazione del DNA viene eseguita il secondo giorno della procedura; recuperare il tubo di digestione dall'incubatrice.In una cappa, aggiungere 500 microlitri di fenolo-cloroformio uno a uno a pH 7 al tubo e vortexare accuratamente. Centrifugare il tubo per 10 minuti a 13.000 ×g. Rimuovere con attenzione la fase acquosa superiore dal tubo senza disturbare l'interfaccia né asportare alcuna parte dello strato organico. Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo.È possibile eseguire una seconda estrazione se l'interfaccia appare torbida. Successivamente, aggiungere un decimo del volume di acetato di sodio tre molar, in questo caso 40 microlitri. Un microlitro di glicogeno può essere utilizzato come vettore per facilitare la purificazione del pellet.Vortexare il tubo per mescolare il contenuto. Quindi aggiungere due volumi di etanolo al 100%, vortexare e congelare in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti dopo il congelamento. Il DNA precipitato viene centrifugato a 13.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Un pellet di DNA si formerà sul fondo del tubo. Rimuovere il tubo dalla centrifuga ed eliminare l'etanolo. Fare attenzione a non disturbare il pellet sul fondo del tubo.Potrebbe essere necessaria una breve centrifugazione per rimuovere l'etanolo residuo. Per lavare il pellet, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% freddo, vortexare e centrifugare nuovamente per 20 minuti a 13.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Al termine della seconda centrifugazione, rimuovere l'etanolo al 70% con una breve centrifugazione ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta.Lasciare il tubo in un portatubi con il cappuccio aperto per far asciugare il pellet e permettere all'etanolo residuo di evaporare. Infine, risospendere il pellet contenente solo DNA arricchito per metilazione in 10 microlitri di acqua sterile, lasciando un tempo sufficiente affinché il pellet di DNA si sciolga prima dell'uso. È buona pratica validare l'efficienza del protocolo mediante PCR.Questo può essere eseguito mediante reazioni di PCR progettate per amplificare prodotti che illustrano in modo differenziale frammenti di DNA metilati e non metilati utilizzando primer per DNA umano normale. La regione di controllo dell'imprinting di H19 può essere utilizzata in combinazione con primer progettati per amplificare una regione del genoma che non è metilata. Esempi di sequenze di primer e condizioni di ciclaggio della PCR sono riportati nel protocollo allegato.A questo punto, è necessario recuperare il DNA di input o di riferimento che era stato messo da parte all'inizio del protocollo di meetup. Verrà impostato un primo insieme di reazioni PCR utilizzando il DNA di input e un secondo insieme utilizzando il DNA IP arricchito per la metilazione. Se il meetup ha avuto successo, la PCR con il DNA IP produrrà un prodotto amplificato utilizzando i primer specifici per la metilazione e nessun prodotto utilizzando i primer di controllo.Al contrario, la PCR di input dovrebbe produrre prodotti utilizzando entrambi i primer, poiché contiene sia frammenti metilati che non metilati. I frammenti di DNA possono essere arricchiti per sequenze metilate e utilizzati per numerose applicazioni successive, come il sequenziamento PCR e l'analisi con microarray.Quando integrata con altre tecniche di biologia molecolare, può essere utilizzata per indagare lo stato di metilazione del DNA in modo specifico per un locus o su scala genomica, al fine di effettuare il profiling della metilazione o studiare l'epigenomica.

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Il gold standard per l'analisi di metilazione del DNA è il sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito. Questo metodo sfrutta l'accresciuta sensibilità della citosina rispetto ai 5-metilcitosina (5-MEC) di bisolfito deaminazione in condizioni acide. Cytosines non metilato può essere distinto dal cytosines metilato dopo amplificazione del DNA genomico di destinazione.

Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

Questo video descrive la tecnica del dot-blot per determinare il livello di metilazione del DNA nei condrociti umani in vitro tramite il blotting di campioni di DNA su una membrana di nylon e la successiva visualizzazione utilizzando anticorpi monoclonali. Questo aiuta a determinare il fenotipo dei condrociti nelle varie fasi della coltura.

5-metilcitosina dot blot per determinare l'entità della metilazione del DNA

Il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta potenziata è un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento per l'analisi della metilazione del DNA basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la conversione del bisolfito di citosina. Questo protocollo richiede 50 ng di materiale di partenza e produce dati di risoluzione delle coppie di basi in regioni genomiche ricche di GC.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

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Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

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