Immunoprecipitazione DNA metilato

Questo video mostra un protocollo per l'immunoprecipitazione del DNA metilato o meetup. Un metodo utilizzato per isolare in modo specifico il DNA metilato in modo imparziale. La metilazione del DNA nei mammiferi è caratterizzata dall'aggiunta di un gruppo metilico alla posizione C 5 della citosina.

Quando presente in un dinucleotide CPG, è un segno epigenetico reversibile che svolge un ruolo importante nel normale sviluppo, così come in diversi processi patologici. Le normali funzioni della metilazione del DNA includono l'inattivazione del cromosoma X nelle femmine, il silenziamento degli elementi ripetitivi, l'imprinting genomico e il mantenimento della stabilità genomica. È stato anche dimostrato che la metilazione del DNA svolge un ruolo in numerose malattie come il cancro, la sindrome di der Willi, la sindrome di Engelman e l'immunodeficienza, l'instabilità centromerica e la sindrome da anomalia facciale.

Nei tumori, ad esempio, l'ipermetilazione e i promotori anomali possono provocare il silenziamento dei geni oncosoppressori vitali. Mentre l'ipometilazione impropria provoca instabilità cromosomica e l'attivazione dell'oncogene, l'incontro si ottiene con il primo pattinaggio sonico del DNA in frammenti di dimensioni variabili da 300 a 1000 coppie di basi. Il DNA sonicato viene quindi denaturato a 95 gradi Celsius.

Gli anticorpi primari, che riconoscono cinque metazine primarie, vengono aggiunti e lasciati legare frammenti di DNA metilato. Gli anticorpi secondari, coniugati a perle di dinamo magnetica, vengono utilizzati per isolare frammenti di DNA, che sono stati legati dall'anticorpo primario. I frammenti non metilati vengono rimossi e gli anticorpi vengono digeriti dalla proteinasi.

La purificazione del cloroformio di fenile KA rimuove la proteina digerita e la precipitazione purifica il DNA, che ora è arricchito per i frammenti metilati. Meetup, il DNA può essere utilizzato per applicazioni come PCR, microarray e sequenziamento. Il meetup viene generalmente eseguito come una procedura di due giorni.

Il primo giorno prevede la preparazione del DNA, la sonicazione, l'immunoprecipitazione e la digestione delle proteine. Il secondo giorno prevede l'estrazione del cloroformio a pH e la precipitazione dell'etanolo per purificare e isolare il DNA arricchito per la metilazione. Ci sono alcuni materiali speciali che sono necessari per l'incontro, tra cui provette da centrifuga siliconate, un dispositivo di sunazione del DNA, anticorpo primario, topo anti cinque metazina, anticorpo monoclonale, anticorpo secondario, perline dyna, coniugate a pecore, IgG anti-USA e un rack per tubi magnetici.

Il primo passo del protocollo meetup è la preparazione del DNA. È imperativo valutare in anticipo la natura del DNA. È necessario conoscere lo stato del DNA del campione, indipendentemente dal fatto che sia principalmente a doppio o singolo filamento, poiché la quantificazione accurata del campione è della massima importanza e vari metodi per determinare la quantità di DNA possono essere influenzati negativamente dalla presenza di specie di DNA indesiderate.

quantità di DNA a doppio filamento può essere valutata facilmente mediante fotometria spettrale utilizzando un NanoDrop 3, 300 nd load da 1,5 microlitri e impostare il tipo di misurazione su acido nucleico, selezionare DNA 50 come calcolo e inizializzare lo strumento con 1,5 microlitri di acqua. Pulire i piedistalli e cancellare lo strumento con 1,5 microlitri di liquido. Il campione viene sciolto in pulire i piedistalli, caricare 1,5 microlitri del campione e colpire la misura.

La concentrazione sarà data e potrà essere utilizzata. Per calcolare il numero di microlitri necessari per me, immergere un rapporto A due 60 a due 80 di 1,8 è l'ideale qui. Viene preparato un campione da un microgrammo.

Tuttavia, un campione di soli 200 nanogrammi è sufficiente per ottenere risultati di successo. Per l'incontro, caricare il campione di DNA in una provetta siliconata pulita. Aggiungere abbastanza acqua sterile Per portare il volume finale a 50 microlitri.

La sonicazione del DNA e l'immunoprecipitazione devono essere eseguite in provette siliconate per evitare il legame aspecifico del DNA e delle proteine alle pareti del tubo. Una volta che il DNA è stato preparato, il campione deve essere sonico è necessaria la sonicazione per frammentare il DNA poiché l'immunoprecipitazione è più efficiente con frammenti di DNA più piccoli, caricare il campione nel sonicato, assicurarsi che l'impostazione della potenza sia impostata su alta e che la macchina sia impostata su 30 secondi. Al 30 secondi di spegnimento, riempire la base nella linea di riempimento con acqua a quattro gradi Celsius.

Sonicare il campione per sette minuti. Al termine della sonicazione, rimuovere il tubo e metterlo sul ghiaccio. È importante ottimizzare in anticipo le condizioni di sonicazione per il campione previsto, le dimensioni del DNA.

Ad esempio, un campione di DNA parzialmente degradato richiederà un tempo di sonicazione più breve. I prodotti della sonicazione possono essere visualizzati con tecniche elettroforetiche standard. A questo punto si desiderano frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 300 e 1000 paia di basi per un uso successivo.

Nei saggi di microarray e PCR, è necessario riservare un quinto del DNA come DNA di input o di riferimento: in questo caso, 800 nanogrammi di DNA sonicato verranno utilizzati per l'immunoprecipitazione e il resto verrà messo da parte come DNA di riferimento. Il passo successivo nel protocollo dei media è l'immunoprecipitazione o reazione IP prima dell'aggiunta dell'anticorpo primario, il DNA deve essere denaturato. La denaturazione è necessaria perché l'anticorpo primario è sensibile al DNA a singolo filamento.

Mettere il campione in un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine della fase di denaturazione, trasferire immediatamente il tubo nel ghiaccio per almeno cinque minuti. Ciò impedirà al DNA di denaturare l'inginocchiamento di Reen e consentirà un legame ottimale degli anticorpi quando il campione si sarà raffreddato.

Girare brevemente il tubo per tirare il contenuto verso il basso. Successivamente, dovrebbe essere aggiunto l'anticorpo primario. La quantità di anticorpi utilizzati deve essere titolata per ogni lotto e per ogni produttore.

In questo caso, aggiungiamo cinque microgrammi di anticorpi primari e poi aggiungiamo un tampone di immunoprecipitazione o un tampone IP fino a un volume finale di 500 microlitri. Successivamente, il DNA IP viene posto in un rotatore e lasciato incubare a quattro gradi Celsius per due ore. La rotazione è necessaria per prevenire il conglomerato di anticorpi all'interno della provetta durante l'incubazione.

Circa 15 minuti prima del completamento dell'incubazione degli anticorpi primari, pulire e preparare le microsfere magnetiche dyna. Per prima cosa, risospendere accuratamente le perle nella fiala Vortex. Quindi trasferire 30 microlitri di perline in una provetta siliconata pulita e posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica per reazioni multiple.

Trasferire 30 microlitri di microsfere per reazione, più una quantità sufficiente per una reazione aggiuntiva per consentire errori di pipettaggio o la perdita involontaria di alcune perline. Ad esempio, per otto reazioni. Rimuovere abbastanza perline per nove reazioni o 270 microlitri.

Le perline magnetiche verranno attirate verso la parete del rack magnetico. Attendere due minuti affinché le perle migrino e si depositino in una striscia definita sulla parete del tubo. Quindi, rimuovere e gettare la pipetta surnatante con attenzione, assicurandosi di evitare di disturbare le perle sulla parete posteriore con la punta della pipetta.

Sostituire il surnatante con un volume in eccesso di vortice tampone IP e rimetterlo sul rack magnetico per due minuti. Ripetere ancora una volta il lavaggio e risospendere le perle di lavaggio nel loro volume originale di buffer IP. Al termine dell'incubazione, recuperare la provetta dal rotatore.

Per completare l'immunoprecipitazione, aggiungere 30 microlitri di perle pulite alla reazione e riposizionare il tubo in un rotatore per due ore a quattro gradi Celsius. Durante questa incubazione, l'anticorpo secondario, che è l'anti-IgG di topo, si legherà all'anticorpo primario di topo. Gli anticorpi anti-topo sono coniugati a perle magnetiche dyna, consentendo un facile recupero dei prodotti legati e la fase di purificazione da seguire.

Una volta completata l'incubazione con entrambi gli anticorpi, posizionare la provetta IP sul rack magnetico per due minuti. A questo punto, il DNA metilato sarà legato dall'anticorpo primario, che a sua volta sarà legato dall'anticorpo secondario coniugato con perline di dyna. Rimuovere ed eliminare il surnatante e sostituirlo con 500 microlitri di tampone IP.

Mescolare il contenuto del tubo e rimetterlo sulla griglia per due minuti. Ripetere ancora una volta il lavaggio con il buffer IP. Dopo aver rimosso il surnatante dall'ultimo lavaggio Resus, sospendere le perle per l'ultima volta.

In 400 microlitri di tampone per la digestione, trattare la reazione con 100 microgrammi di proteinasi K e incubare per una notte a 50 gradi Celsius. Il trattamento con proteinasi K è necessario per digerire le proteine anticorpali e qualsiasi proteina residua associata al DNA, consentendo il rilascio in soluzione del DNA metilato. La purificazione del DNA viene effettuata il secondo giorno della procedura di meetup, recuperare il tubo digest dall'incubatrice.

In una cappa aspirante, aggiungere 500 microlitri di fenocloroformio uno-a-uno a pH sette alla provetta e agitare accuratamente Girare la provetta per 10 minuti a 13.000. G.Rimuovere con cautela la fase acquosa superiore dal tubo senza disturbare l'interfaccia o rimuovere lo strato organico. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta.

Una seconda estrazione può essere eseguita se l'interfaccia appare nuvolosa. Quindi, aggiungi un decimo volume di acetato di sodio a tre molari in questo caso, 40 microlitri. Un microlitro di glicogeno può essere utilizzato come vettore per facilitare la pulizia dei pellet.

Agitare il tubo per mescolare il contenuto. Quindi aggiungere due volumi di etanolo al 100%, agitare e congelare in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti dopo il congelamento. Il DNA precipitato viene centrifugato a 13.000 G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Un pellet di DNA si formerà sul fondo del tubo. Recuperare la provetta dalla centrifuga e rimuovere l'etanolo. Fare attenzione a non disturbare il pellet sul fondo del tubo.

Potrebbe essere necessaria una centrifuga a impulsi per rimuovere eventuali residui di etanolo. Per lavare il pellet, aggiungere 500 microlitri di vortice di etanolo freddo al 70% e centrifugare di nuovo per 20 minuti a 13.000 G e quattro gradi Celsius. Al termine della seconda centrifuga, rimuovere la centrifuga a impulsi di etanolo al 70% e rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta.

Lasciare la provetta su una griglia con il tappo aperto per asciugare il pellet e consentire all'etanolo rimanente di evaporare. Infine, Reus sospende il pellet contenente solo DNA arricchito per la metilazione e 10 microlitri di acqua sterile, lasciando un tempo sufficiente affinché il pellet di DNA si sciolga prima dell'uso. È buona norma convalidare la competenza del meetup mediante PCR.

Questo può essere fatto eseguendo reazioni di PCR progettate per amplificare i prodotti che illustrano in modo differenziato i frammenti di DNA metilato e non metilato per l'amplificazione dei normali primer di DNA umano. La regione di controllo dell'imprinting H 19 può essere utilizzata in combinazione con primer progettati per amplificare una regione del genoma, che non è metilata. Ad esempio, le sequenze di primer e le condizioni di ciclo della PCR possono essere trovate nel protocollo allegato.

A questo punto, è necessario recuperare il DNA di input o di riferimento che è stato messo da parte all'inizio del protocollo di meetup. Una serie di reazioni PCR sarà impostata utilizzando il DNA in ingresso e l'altra serie utilizzerà il DNA IP arricchito per la metilazione. Se l'incontro ha avuto successo, l'IP PCR produrrà un prodotto utilizzando i primer di metilazione e nessun prodotto utilizzando i primer di controllo.

Al contrario, la PCR in ingresso dovrebbe produrre prodotti utilizzando entrambi i primer in quanto contiene sia metilato che non metilato. Frammenti di DNA. Il DNA arricchito per i frammenti metilati può essere utilizzato per una serie di applicazioni a valle, come il sequenziamento PCR e l'analisi di microarray.

Se integrato con altre tecniche di biologia molecolare, può essere utilizzato per studiare lo stato di metilazione del DNA in modo locus specific o genomico per la profilazione della metilazione o lo studio dell'epigenomica.