Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Ciao, sono Mike Dustin del Geral Institute e della New York University School of Medicine. Oggi vi guiderò attraverso la procedura di formazione di Biolay planare di supporto per lo studio della sinapsi immunologica. Quindi iniziamo.

Per realizzare il doppio strato lipidico, prepariamo una soluzione di nichel al 20%, lipidi chelanti e fosfatidilcolina all'80% nelle quantità appropriate in una provetta di vetro con uno o due millilitri di metanolo cloroformio. Il primo passo consiste nell'evaporare il solvente sotto un flusso di azoto gassoso in un bagno d'acqua caldo da 30 a 37 gradi Celsius. Questo di solito richiede circa 15 minuti.

Quindi rimuovere l'eventuale solvente rimanente sotto vuoto utilizzando un liofilizzatore per 90 minuti. Successivamente, sciogliere i lipidi nel tampone salino detergente per l'interesse del glucocida ottale al 2% di N fino a una concentrazione finale di 0,4 millimolari. Questo crea una soluzione di micocellule fosfolipidiche detergenti miste per formare liposomi.

Si dializza questa soluzione contro tre cambi di soluzione salina per rimuovere il detersivo e formare liposomi. Di solito lavoriamo con volumi dell'ordine di un millilitro con tubi di sei millimetri di diametro con un taglio di circa 10 kilodalton e facciamo attenzione a escludere eventuali bolle d'aria durante il serraggio del tubo. Filtriamo sterile questa soluzione ed eseguiamo la dialisi in condizioni pulite e la maneggiamo utilizzando guanti sterilizzati con etanolo al 70%.

Questa soluzione deve essere cristallina e deve essere conservata sotto il gas Argonne per prevenire l'ossidazione. Se la soluzione è torbida, allora hai generato vescicole a più pareti ed è necessario ricominciare da capo. Per avviare l'esperimento, dobbiamo prima determinare quanto ICAM one e MHC sono depositati su una data area superficiale del doppio strato chelante del nichel a una data concentrazione di proteina solubile.

Per fare ciò, depositiamo doppi strati su velocità di vetro di cinque micrometri di diametro. Incubare le perle di vetro con soluzioni proteiche in condizioni che si avvicinano a quelle delle celle a flusso utilizzate per l'imaging, quindi leggere la densità della proteina legata mediante un saggio immuno fluorometrico a flusso. Gli anticorpi marcati FSI con un numero noto di fluoresceina per molecola vengono utilizzati per rilevare le proteine legate alla superficie e le microsfere standard di fluoresceina vengono utilizzate per calibrare il microfluorimetro a flusso.

Stabiliremo condizioni che si avvicinano a quelle delle cellule presentanti l'antigene con 200 molecole per micrometro quadrato di ICAM uno e da 0,2 a 20 molecole per quadrato. Micrometro di I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, i doppi strati planari complessi si formano spontaneamente quando i liposomi si fondono con il vetro, ma solo se viene adeguatamente pulito per pulire il vetro. Utilizziamo la soluzione di piana acida, una miscela preparata al momento di acido solforico e perossido di idrogeno al 30%, che distrugge tutto il materiale organico e lascia anche la superficie del vetro molto idrofila.

Quando lavoriamo con i piranha, indossiamo indumenti protettivi completi, tra cui un grembiule acido e guanti pesanti resistenti agli acidi. I rifiuti devono essere accuratamente separati dai rifiuti organici e smaltiti correttamente. Per preparare la soluzione acida di piranha, aggiungere 75 millilitri di acido solforico concentrato in un becher asciutto e poi aggiungere con cura 25 millilitri di perossido di idrogeno al 30%.

La soluzione si riscalda rapidamente fino a superare i 100 gradi Celsius, quindi immergere i vetrini coprioggetti asciutti nella soluzione per 15 minuti. Dopo questa incubazione nei piranha, immergere i vetrini copricoperchio in acqua purificata e poi sciacquarli per un minuto su ciascun lato. Quindi asciugare i vetrini di copertura utilizzando una fonte di aspirazione per drenare l'acqua purificata.

Lasciare raffreddare la soluzione di piranha e aggiungerla al contenitore dei rifiuti di piranha, che viene lasciato con un tappo allentato, ben segnato nella cappa aspirante per formare i doppi strati. Il nostro laboratorio utilizza bi FCS a due camere, che presentano i vantaggi del riscaldamento integrato. Il sistema FCS two è su una base in acciaio inox che blocca insieme un collettore microfluidico con una guarnizione superiore da 0,5 millimetri, una slitta per microacquedotto rivestita con ossido di indio stagno per il riscaldamento su una superficie e con una scanalatura fluidica sull'altro lato.

Una guarnizione antipolvere da 0,25 millimetri che definisce l'altezza della camera di flusso e il vetrino di copertura rotondo da 40 millimetri pulito con piranha su cui si forma il doppio strato per assemblare la cella di flusso e formare doppi strati planari. Posizionare il collettore con i tubi rivolti verso l'alto su una superficie piana. Quindi posizionare la guarnizione da 0,5 millimetri con i fori posizionati sopra i tubi fluidici e assicurarsi che sia posizionata in piano.

Posizionare delicatamente la guida del microacquedotto con i canali fluidici rivolti verso l'alto e assicurarsi che sia in piano senza applicare alcuna pressione verso il basso fino a verificare che i fori nella guida allineino i tubi microfluidici. Quindi posare la guarnizione da 0,25 millimetri priva di polvere con un ritaglio rettangolare sulla parte superiore della diapositiva del micro acquedotto in modo che il canale sia allineato con i canali fluidici e non ci siano grandi spazi d'aria, posizionare fino a cinque gocce da un microlitro di sospensione liposomica sulla superficie della diapositiva del micro acquedotto in uno schema tale che l'interasse tra ogni goccia sia di 2,5 millimetri. Le cinque gocce di liposomi possono avere composizioni diverse, ma in questo caso formeremo solo due doppi strati, uno senza lipidi chelanti di nichel e uno con il 10% di lipidi chelanti di nichel.

Una volta posizionate queste gocce, posizionare con cautela il vetrino coprioggetto sulla superficie con un solo movimento, fissarlo alla base il più rapidamente possibile. Le gocce di liposomi devono entrare in contatto con il vetrino coprioggetti. Questo contatto non deve essere interrotto poiché i doppi strati si sono probabilmente già formati e qualsiasi interruzione può causare doppi strati difettosi.

A questo punto, è importante ricordarsi di segnare le posizioni dei doppi strati con alcuni piccoli punti di inchiostro sul vetrino per facilitare il posizionamento del vetrino sul microscopio. Attendere 20 minuti per assicurarsi che il sistema abbia bilanciato trasferire tutte le soluzioni utilizzando una siringa da 20 millilitri collegata a circa 20 centimetri di tubo flessibile e un rubinetto di arresto a tre vie. Un'altra porta del rubinetto di arresto è quindi collegata alla cella di flusso da un breve tratto di tubo per ridurre al minimo il volume morto tra il rubinetto di arresto e la cella di flusso.

Riempire la siringa con soluzione salina tamponata heis contenente cloruro di magnesio, cloruro di calcio, glucosio e albumina sierica umana. Adescare il tubo e arrestare il rubinetto in modo che non ci siano bolle d'aria. Quindi collegalo alle celle di flusso e spingi attraverso cinque millilitri in un solo movimento mentre osservi per assicurarti che non passino bolle d'aria sul doppio strato.

Ora avrai i tuoi doppi strati per introdurre le proteine con tag sibilante nel doppio strato. Deve prima essere bloccato con casene e caricato con nichel. Riempi una siringa da un millilitro con la soluzione di ioni casen nichel e collegala alla porta laterale senza intrappolare bolle d'aria.

Dopo aver iniettato la soluzione, attendere 20 minuti per consentire il blocco completo. Quindi lavare via la soluzione bloccante con H-B-S-H-S-A dalla siringa da 20 millilitri. Ora iniettare 0,5 millilitri di soluzione H-B-S-H-S-A contenente il polihité taggato ICAM one e IEK.

In questo esperimento, quello ICAM è etichettato con SCI cinque. Quindi le interazioni LFA-1, ICAM, 1 possono essere seguite dall'imaging dell'ICAM, un riarrangiamento nel doppio strato consente alla proteina di legarsi al doppio strato caricato di nichel mentre la proteina aderisce al doppio strato. Fissare la cella di flusso al microscopio invertito utilizzando un inserto tavolino personalizzato.

Quindi collegare l'elettronica di riscaldamento per consentire al sistema di equilibrarsi a 37 gradi Celsius. Utilizzare i segni fatti in precedenza per posizionare la cella di flusso in modo che l'obiettivo sia allineato con uno dei doppi strati e utilizzare la microscopia a riflessione per interferenza per localizzare il piano focale concentrandosi sull'immagine a luce riflessa del diaframma di campo. Infine, lavare via quello ICAM non legato dalle celle a flusso.

Acquisizione di immagini a fluorescenza del doppio strato nel canale ICAM one in modalità turf M e widefield. Questo per confermare ICAM un legame sul doppio strato nichelato rispetto al doppio strato senza nichel. La cella a flusso è ora pronta per ricevere le celle.

Per questa dimostrazione, utilizzeremo un recettore delle cellule T ND che sono state trasdotte con un rivestimento ENC retrovirale GFP P zap 70, laveremo le cellule una volta con H-B-S-H-S-A e poi incuberemo le cellule con un Alexa 5 68 marcato FAB sul recettore delle cellule T in modo da poter tracciare i micro cluster TCR. Dopo 15 minuti, diluire le cellule da una a 10. Questo diluisce l'anticorpo H 57 abbastanza da non interferire con l'imaging M del tappeto erboso, ma mantiene la saturazione del recettore delle cellule T quando la fab inizialmente legata inizia a dissociarsi, quindi li inietta nella cella di flusso.

Immaginiamo la sinapsi immunologica in modalità M a tre colori. Ciò include la formazione dell'interazione LFA one, ICAM one, la formazione di cluster TCR e C smac e la formazione sostenuta di micro cluster TCR, che reclutano GFP ZAP 70. Alcuni di questi risultati sono evidenti durante l'acquisizione, mentre altri richiedono un'analisi post-elaborazione per essere apprezzati appieno.

Ok, ti abbiamo appena mostrato come utilizzare i doppi strati planari supportati per studiare la sinapsi immunologica. È molto importante per questi esperimenti che le cellule T siano in ottima forma e che la soluzione salina tamponata con PPS non sia molto adatta alla coltura di cellule T a lungo termine. Quindi si vogliono togliere le cellule dalla coltura, metterle in questo terreno e poi usarle molto rapidamente.

Se ti accorgi di voler fare esperimenti a lungo termine, ci sono alcune ottime formulazioni di terreni privi di siero che puoi sostituire con la soluzione salina tamponata. Ciò manterrà le cellule in vita molto più a lungo se si desidera avere un endpoint più lungo, come la produzione di citochine o la proliferazione delle cellule T. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.