Name: Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri come creare bilayer planari supportati per studiare la formazione della sinapsi immunologica. Questo metodo utilizza microscopia TIRF per visualizzare le interazioni molecolari tra cellule immunitarie.

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1. Preparare i lipidi <ol><li> Al fine di collegare le proteine ​​il foglio superiore di un doppio strato, usiamo Ni 2 + lipidi chelanti, che ancorano proteine ​​ricombinanti con poli-istidina tag. Alcuni tipi di cellule possono aderire in modo non specifico per Ni 2 + rivestite doppi strati, ma le cellule T generalmente non, rendendo questo metodo ottimale per studiare l&#39;attivazione delle cellule T. </li><li> La soluzione doppio strato lipidico è costituito da preparando una soluzione di 20% di Ni 2 + lipidi chelante fosfatidilcolina e 80% per l&#39;importo adeguato a un tubo di vetro con 1-2 ml di cloroformio-metanolo. <ol><li> Far evaporare il solvente sotto un flusso di azoto in un ambiente caldo (30-37 ° C), acqua sporca. Questo richiede di solito circa 15 minuti. </li><li> Rimuovere eventuali solvente rimanente sotto alto vuoto, utilizzando un liofilizzatore per 90 minuti. </li></ol></li><li> Sciogliere i lipidi nel 2% diottile-glucoside detergente in tampone Tris-salino, che crea una soluzione di detergente misto / fosfolipidi micelle. La concentrazione dei fosfolipidi finale dovrebbe essere 0,4 mm. Per formare liposomi, Dializzare di questa soluzione con 3 cambi di Tris-salino per rimuovere liposomi detergente e forma. Di solito lavoro con volumi dell&#39;ordine di 1 ml con 6 mm di diametro Spectra / Por # 2 tubi con un cut-off di circa 10 kDa. Stiamo attenti a escludere qualsiasi s bolle d&#39;aria per il fissaggio del tubo. Noi di solito sterile-filtro questa soluzione e fare la dialisi in condizioni di pulizia, la movimentazione usando guanti di etanolo al 70% sterilizzati. </li><li> Questa soluzione dovrebbe essere cristallino. E &#39;conservato in gas argon per evitare l&#39;ossidazione. Se la soluzione è torbida, poi multi-parete vescicole sono stati generati, e sarà necessario ricominciare da capo. </li></ol> 2. Determinare la quantità di ICAM-1 e MHC si depositano sul doppio strato planare <ol><li> Per impostare l&#39;esperimento, è prima necessario determinare la quantità di ICAM-1 e MHC sono depositate su una superficie dato di Ni 2 + chelanti bilayer a una data concentrazione di proteina solubile. Per fare questo, bilayers deposito il 5 micrometri di diametro perle di vetro, incubare le perle di vetro con le soluzioni di proteine ​​che approssimano quelli delle celle di flusso utilizzato per l&#39;imaging, e leggere la densità delle proteine ​​da un saggio di flusso immunofluorometric. Condizioni </li><li> Gli anticorpi coniugati con fluoresceina con un numero noto di fluorescina per molecola vengono utilizzati per rilevare la superficie è legato proteine. Fluoresceina sfere standard sono utilizzati per calibrare il microfluorimeter flusso. </li><li> Creeremo le condizioni che approssimano quelle cellule presentanti l&#39;antigene con 200 molecules/μm2 di ICAM-1 e 0,2-20 molecules/μm2 di I-Ek-MCC91-103 complessi. </li></ol> 3. Pulizia del vetro di copertura scivola per la formazione di doppi strati planari <ol><li> Doppi strati planari forma spontaneamente quando i liposomi fusibile di vetro, ma solo se il bicchiere sia ben pulito. </li><li> Quando si lavora con Piranha, abbiamo indossare idonei indumenti protettivi, tra cui un grembiule acido e pesante, guanti resistenti agli acidi. Con attenzione separare i rifiuti da rifiuti organici e smaltire in modo corretto. </li><li> Per preparare la soluzione Piranha acido, aggiungere 75 ml di acido solforico concentrato in un recipiente asciutto, ed aggiungere con cautela 25 ml di acqua ossigenata al 30%. La soluzione si riscalda rapidamente fino a oltre 100 ° C. </li><li> Immergere i coprioggetti secco nella soluzione per 15 minuti. Rimuovere dalla soluzione e sciacquare con acqua purificata per un minuto su ogni lato. Asciugare il coprioggetto utilizzando una fonte di vuoto per drenare l&#39;acqua purificata. Lasciare che la soluzione Piranha raffreddare e aggiungere al contenitore dei rifiuti Piranha, che è lasciata con il tappo sciolti, ben marcato nella cappa. Quando tutti i liposomi, coprioggetto, e le proteine ​​sono preparati, la sinapsi immunologica è pronto per essere formata. </li></ol> 4. Formare i doppi strati <ol><li> Per formare i doppi strati, il nostro laboratorio utilizza Bioptechs FCSII camere, che hanno il vantaggio di riscaldamento integrato. Il sistema FCSII è su una base in acciaio inox fascette insieme un collettore microfluidica con una guarnizione 0,5 millimetri superiore, una diapositiva microaqueduct rivestito con ossido di indio e stagno per il riscaldamento su una superficie, con scanalatura fluidico dall&#39;altro lato, una polvere 0,25 millimetri guarnizione che definisce l&#39;altezza della camera di flusso e il Piranha pulito coprioggetto 40 mm rotondo sul quale si forma il doppio strato. </li><li> Mentre il vetrino, sul quale si forma il doppio strato, deve essere altamente idrofili e pulito, la diapositiva microacqueduct effettivamente funziona meglio se è più idrofobo. Rendere il idrofobo microaqueduct più si ottiene trattando con l&#39;1% HSA per 60 minuti a temperatura ambiente, poi lavaggio con acqua pura e il completo indurimento dopo questo processo di condizionamento, così come tra usi. Il rivestimento di proteine ​​denaturate lasciata da questa procedura consente di 1 ml di sospensione di liposomi per formare una rotonda, hemispherical goccia che è&gt; 0,25 mm di altezza. </li><li> Per assemblare la cella a flusso e la forma doppi strati planari, posto il collettore, con i tubi diretta verso l&#39;alto, su una superficie piana. Poi, collocare il 0. Guarnizione 5 mm con fori posizionato sopra i tubi fluidico, assicurandosi che sia seduto piatto. Posizionare con delicatezza il lato microaqueduct sulla guarnizione con i canali fluidico rivolto verso l&#39;alto, e assicurarsi che i sedili piatto senza applicare alcuna pressione verso il basso, fino a verificare che i fori nella diapositiva allinearsi con i tubi microfluidica. Stendere la polvere guarnizione 0,25 mm con un taglio rettangolare sulla parte superiore della diapositiva microaqueduct modo che il canale sia in linea con i canali fluidici e non ci sono spazi d&#39;aria principali. </li><li> Posto fino a 5 gocce x 1 ml di sospensione liposomi sulla superficie del vetrino microaqueduct in un modello tale che il centro a centro distanza tra ogni goccia è di 2,5 mm. Il 5 gocce di liposomi possono avere composizioni diverse, ma in questo caso ci sarà solo formano due doppi strati, uno senza Ni 2 + + lipidi chelante e uno con il 10% Ni 2 + + lipidi chelanti. </li><li> Una volta che queste gocce sono in atto, posizionare con attenzione il coperchio scivolare sulla superficie in un unico movimento. Morsetto nella base il più rapidamente possibile. Le gocce liposomi dovrebbe entrare in contatto con la polizza di copertura. Questo contatto non deve essere spezzato, dal momento che bilayers hanno probabilmente già formate, qualsiasi interruzione può provocare doppi strati difettoso. </li><li> E &#39;importante ricordarsi di segnare le posizioni dei doppi strati con pochi punti di inchiostro piccolo della diapositiva microacqueduct ausilio per il posizionamento del vetrino sul microscopio. Attendere 20 minuti per assicurarsi che il sistema è equilibrato. Trasferire tutte le soluzioni utilizzando una siringa da 20 ml collegata a circa 20 cm di tubo flessibile ed un rubinetto a 3 vie. Collegare un altro porto del rubinetto di arresto nella cella di flusso per un breve tratto di tubo ridurre al minimo il volume morto tra il rubinetto e la cella di flusso. Riempire la siringa con HEPES soluzione tampone contenente 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 1% di albumina umana. </li><li> Primo il tubo e rubinetto quindi non ci sono bolle d&#39;aria. Collegare questo alle cellule di flusso e pressione a 5 ml in un unico movimento mentre si guarda per assicurarsi che bolle d&#39;aria passare il doppio strato. Ora, avrete il vostro doppi strati. </li></ol> In questo articolo video supporta &quot;Hunter Gatherer e Back: Le sinapsi immunologica e Kinapses come variazioni sul tema di locomozione ameboide&quot; di <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Annual Review di Biologia Cellulare e dello Sviluppo</a> , Volume 24, 2008.

supportato bilayers planar per la formazione degli studi di sinapsi immunologica e kinapse

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Per simulare le interazioni tra i linfociti e le cellule presentanti l&#39;antigene, si usa Ni2 +-chelante lipidi per ancorare l&#39;adesione delle cellule e proteine ​​ricombinanti MHC il foglio superiore di un doppio strato di poli-istidina tag. Doppi strati planari sono generate da preparazione dei lipidi, trattando le superfici di vetro, dove si forma il doppio strato, e poi formando il doppio strato in una sezione specializzata che contiene un flusso di celle dove i linfociti saranno aggiunti. Poi, doppi strati sono accusati di Ni e il suo-tagged proteine ​​ricombinanti sono aggiunti. Infine, i linfociti vengono iniettati nella cellula di flusso e microscopia TIRF possono essere utilizzati per la formazione di sinapsi immagine ed i meccanismi che controllano la locomozione delle cellule T, siti di smistamento dei recettori, e siti di degradazione del recettore.

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l&#39;ancoraggio delle proteine ​​di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

I bilayer planari supportati sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Per mimare le interazioni...

Ciao, sono Mike Dustin dell'Istituto Geral e della Scuola di Medicina della New York University. Oggi vi illustrerò la procedura per formare un supporto planare di Biolay per lo studio della sinapsi immunologica. Cominciamo.Per ottenere il doppio strato lipidico, prepariamo una soluzione costituita dal 20% di lipide chelante del nickel e dall'80% di fosfatidilcolina in quantità adeguate in un tubo di vetro con uno o due millilitri di cloroformio-metanolo. Il primo passaggio consiste nell'evaporare il solvente sotto un flusso di gas azoto in un bagno d'acqua caldo a 30-37 gradi Celsius. Questo processo richiede solitamente circa 15 minuti.Quindi rimuovere qualsiasi solvente residuo sotto vuoto spinto utilizzando un liofilizzatore per 90 minuti. Successivamente, sciogliere i lipidi in un tampone salino con detergente glucocide ottilico al 2% N fino a una concentrazione finale di 0,4 millimolare. Questo crea una soluzione di micelle miste di detergente e fosfolipidi per formare liposomi.Dializzate questa soluzione contro tre cambi di soluzione salina al tris per rimuovere il detergente e formare i liposomi. Di solito lavoriamo con volumi dell'ordine di un millilitro, utilizzando tubi

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Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l'attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

In questo video, dimostriamo una procedura per studiare l'organizzazione della septina su un doppio strato lipidico supportato da vetro in vitro utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale.

Saggio a doppio strato lipidico supportato planare: una tecnica in vitro basata sulla microscopia per studiare l'assemblaggio della septina su imitazioni della membrana biologica

Questo video mostra una tecnica per visualizzare la formazione della sinapsi immunologica nelle cellule natural killer (NK) su un doppio strato lipidico supportato (SLB). L'SLB viene prima marcato con un ligando del recettore attivante delle cellule NK marcato con fluoroforo, seguito dall'incubazione con cellule NK. Successivamente, le cellule vengono colorate per l'actina polimerizzata e i granuli litici perforin-positivi. Questo approccio consente la visualizzazione della formazione delle...

Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

Questo video dimostra una tecnica in vitro per studiare la formazione di sinapsi immunitarie tra le cellule T umane primarie e i doppi strati lipidici supportati (SLB). Le proteine della superficie delle cellule T interagiscono con i rispettivi ligandi immobilizzati su SLB per formare una sinapsi immunitaria, seguita dal movimento dei granuli litici verso la sinapsi, che viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per studiare l'interazione delle cellule T con i doppi strati lipidici planari supportati

Questo video mostra l'imaging di cellule vive della topologia immunologica delle sinapsi, studiando le interazioni tra i linfociti T e le cellule epiteliali che trasportano antigeni fluorescenti. La microscopia a fluorescenza rivela lo spostamento del citoplasma rosso e gli anelli gialli della membrana nelle cellule endoteliali, indicando la formazione di sinapsi immunologiche.

Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

Descriviamo qui una combinazione della tecnica del doppio strato lipidico supportato da vetro per formare sinapsi immunologiche con la tecnica di imaging a super-risoluzione della microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti le istruzioni necessarie per eseguire con successo queste due tecniche.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Qui descriviamo due approcci per caratterizzare gli eventi di polarizzazione cellulare nei linfociti B durante la formazione di un IS. Il primo, comporta la quantificazione del reclutamento di organelli e riarrangiamenti del citoscheletro nella membrana sinaptica. Il secondo è un approccio biochimico, per caratterizzare i cambiamenti nella composizione del centrosome, che subisce la polarizzazione alla sinapsi immunitaria.

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

Questo protocollo immagini sia la formazione di sinapsi immunologica che il successivo traffico secretoria polarizzato verso la sinapsi immunologica. I coniugati cellulari si formarono tra una cellula Raji dal polso superantigeno (che fungeva da cellula che presenta l'antigene) e un clone di Jurkat (che fungeva da aiutante echeggiatore del linfocito T).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

Qui presentiamo il protocollo per la ricostituzione graduale di cellule sintetiche che presentano antigene utilizzando Bead-Supported Lipid Bilayers e il loro uso per interrogare l'output sinaptico dalle cellule T attivate.

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Scopri come creare bilayer planari supportati per studiare la formazione della sinapsi immunologica. Questo metodo utilizza microscopia TIRF per visualizzare le interazioni molecolari tra cellule immunitarie.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

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