Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Ciao, sono Mike Dustin dell'Istituto Geral e della Scuola di Medicina della New York University. Oggi vi illustrerò la procedura per formare un supporto planare di Biolay per lo studio della sinapsi immunologica. Cominciamo.

Per ottenere il doppio strato lipidico, prepariamo una soluzione costituita dal 20% di lipide chelante del nickel e dall'80% di fosfatidilcolina in quantità adeguate in un tubo di vetro con uno o due millilitri di cloroformio-metanolo. Il primo passaggio consiste nell'evaporare il solvente sotto un flusso di gas azoto in un bagno d'acqua caldo a 30-37 gradi Celsius. Questo processo richiede solitamente circa 15 minuti.

Quindi rimuovere qualsiasi solvente residuo sotto vuoto spinto utilizzando un liofilizzatore per 90 minuti. Successivamente, sciogliere i lipidi in un tampone salino con detergente glucocide ottilico al 2% N fino a una concentrazione finale di 0,4 millimolare. Questo crea una soluzione di micelle miste di detergente e fosfolipidi per formare liposomi.

Dializzate questa soluzione contro tre cambi di soluzione salina al tris per rimuovere il detergente e formare i liposomi. Di solito lavoriamo con volumi dell'ordine di un millilitro, utilizzando tubi di diametro di sei millimetri con un limite di cutoff di circa 10 chilodalton, avendo cura di escludere eventuali bolle d'aria durante il serraggio del tubo. Questa soluzione viene filtrata in condizioni sterili e la dialisi viene eseguita in condizioni pulite, manipolando il campione con guanti sterilizzati al 70% di etanolo.

Questa soluzione deve essere perfettamente limpida ed è conservata sotto gas Argonne per prevenire l'ossidazione. Se la soluzione è torbida, allora sono stati generati vescicole multistrato e occorre ricominciare. Per impostare l'esperimento, dobbiamo innanzitutto determinare quanto ICAM-1 e MHC vengono depositati su una determinata area superficiale di un bilayer chelante il nichel a una data concentrazione di proteina solubile.

Per fare ciò, depositiamo strati bilaminari su microsfere di vetro con diametro di cinque micrometri. Incubiamo le microsfere di vetro con soluzioni proteiche in condizioni che approssimano quelle delle celle a flusso utilizzate per l'acquisizione delle immagini, quindi misuriamo la densità delle proteine legate mediante un saggio immuno fluorimetrico a flusso. Anticorpi marcati con FSI, contenenti un numero noto di fluoresceina per molecola, vengono utilizzati per rilevare le proteine legate alla superficie, mentre microsfere standard di fluoresceina vengono impiegate per la calibrazione del fluorimetro a flusso.

Stabilirò condizioni che approssimano quelle presenti sulle cellule presentanti l'antigene con 200 molecole per micrometro quadrato di ICAM-1 e da 0,2 a 20 molecole per micrometro quadrato di I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. I bilayer piani complessi si formano spontaneamente quando i liposomi si fondono al vetro, ma solo se quest'ultimo è stato adeguatamente pulito. Utilizziamo una soluzione di piranha, una miscela appena preparata di acido solforico e perossido di idrogeno al 30%, che distrugge tutti i materiali organici e lascia inoltre la superficie del vetro fortemente idrofila.

Quando si lavora con il piranha, indossiamo indumenti protettivi completi, inclusi un grembiule antiacido e pesanti guanti resistenti agli acidi. Lo smaltimento deve essere accuratamente separato dai rifiuti organici e gestito in modo appropriato. Per preparare la soluzione acida di piranha, aggiungere 75 millilitri di acido solforico concentrato in un becher asciutto e quindi aggiungere con attenzione 25 millilitri di perossido di idrogeno al 30%.

La soluzione si riscalda rapidamente a oltre 100 gradi Celsius; quindi immergere le lamelle asciutte nella soluzione per 15 minuti. Dopo questa incubazione nella soluzione piranha, immergere le lamelle in acqua purificata e risciacquarle per un minuto su ciascun lato. Successivamente, asciugare le lamelle utilizzando una fonte di vuoto per rimuovere l'acqua purificata.

Lasciare raffreddare la soluzione di piranha e aggiungerla al contenitore per rifiuti di piranha, che viene lasciato con il tappo allentato e ben contrassegnato all'interno della cappa per formare i bicchieri lipidici. Il nostro laboratorio utilizza celle bi FCS a due camere, che presentano il vantaggio di un riscaldamento integrato. Il sistema FCS due poggia su una base in acciaio inossidibile che unisce tramite morsetto un collettore microfluidico con una guarnizione superiore da 0,5 millimetri, una lamella microcanale rivestita con ossido di indio e stagno per il riscaldamento su una superficie e con una scanalatura fluidica sull'altro lato.

Un guarnizione da 0,25 millimetri priva di polvere che definisce l'altezza della camera di flusso e il vetrino circolare da 40 millimetri pulito con piranha su cui si forma il doppio strato, per assemblare la cella di flusso e formare doppi strati planari. Posizionare la testata con i tubi rivolti verso l'alto su una superficie piana. Quindi posizionare la guarnizione da 0,5 millimetri con i fori allineati sopra i tubi fluidici e assicurarsi che sia ben appoggiata e in piano.

Posizionare delicatamente la lamella con il microacquedotto in modo che i canali fluidici siano rivolti verso l'alto e assicurarsi che appoggi in piano senza esercitare alcuna pressione verso il basso, fino a quando non si verifica che i fori della lamella siano allineati con i tubi microfluidici. Successivamente, posare sopra la lamella con il microacquedotto la guarnizione spessa 0,25 millimetri e priva di polvere, con un'apertura rettangolare, in modo che il canale sia allineato con i canali fluidici e non vi siano ampi spazi d'aria. Disporre fino a cinque gocce da un microlitro di sospensione di liposomi sulla superficie della lamella con il microacquedotto, in un modello tale per cui la distanza tra i centri di ciascuna goccia sia di 2,5 millimetri. Le cinque gocce di liposomi possono avere composizioni diverse, ma in questo caso verranno formati solo due bicchieri lipidici: uno senza lipidi chelanti il nichel e uno con il 10% di lipidi chelanti il nichel.

Una volta posizionate queste gocce, posizionare con attenzione il coprioggetto sulla superficie con un unico movimento e fissarlo alla base nel minor tempo possibile. Le gocce di liposomi dovrebbero entrare in contatto con il coprioggetto. Questo contatto non deve essere interrotto, poiché i bicchieri lipidici si sono probabilmente già formati e qualsiasi perturbazione potrebbe causare la formazione di bicchieri difettosi.

A questo punto, è importante ricordare di segnare le posizioni dei bistrati con alcuni piccoli punti di inchiostro sul vetrino per facilitare il posizionamento del coprioggetto sul microscopio. Attendere 20 minuti per assicurarsi che il sistema abbia raggiunto l'equilibrio, quindi trasferire tutte le soluzioni utilizzando una siringa da 20 millilitri collegata a circa 20 centimetri di tubo flessibile e a un rubinetto a tre vie. Un altro attacco del rubinetto viene quindi collegato alla cella a flusso mediante un breve tratto di tubo, al fine di minimizzare il volume morto tra il rubinetto e la cella a flusso.

Riempire la siringa con soluzione salina hepes contenente cloruro di magnesio, cloruro di calcio, glucosio e albumina sierica umana. Espellere le bolle d'aria dalla tubatura e dal rubinetto. Quindi collegare il tutto alle celle di flusso e spingere cinque millilitri in un'unica movimento, controllando attentamente che nessuna bolla d'aria passi attraverso il doppio strato lipidico.

Ora si avranno i bicchieri lipidici in cui introdurre le proteine marcate con hiss. Questi devono prima essere bloccati con la casena e caricati con nichel. Riempire una siringa da un millilitro con la soluzione di ioni di casena e nichel e collegarla al port laterale senza intrappolare bolle d'aria.

Dopo aver iniettato la soluzione, attendere 20 minuti per consentire un blocco completo. Quindi rimuovere la soluzione di blocco lavando con H-B-S-H-S-A dalla siringa da 20 millilitri. Ora iniettare 0,5 millilitri di soluzione H-B-S-H-S-A contenente ICAM-1 marcati con polihistidina e IEK.

In questo esperimento, l'ICAM uno viene marcato con SCI cinque. In questo modo, le interazioni tra LFA uno e ICAM uno possono essere seguite mediante imaging del riarrangiamento di ICAM uno nel bicchierino. Attendere 30 minuti per consentire al proteina di legarsi al bicchierino carico di nichel; durante questo periodo la proteina aderisce al bicchierino. Fissare la cella a flusso al microscopio invertito utilizzando un inserto personalizzato per la piastra.

Quindi collegare l'elettronica di riscaldamento per permettere al sistema di raggiungere l'equilibrio a 37 gradi Celsius. Utilizzare i segni effettuati in precedenza per posizionare la cella a flusso in modo che l'obiettivo sia allineato con uno dei bicchieri lipidici e usare la microscopia a riflessione interferenziale per individuare il piano focale mettendo a fuoco l'immagine della luce riflessa dello diaframma di campo. Infine, lavare via l'ICAM-1 non legato dalle celle a flusso.

Acquisire immagini di fluorescenza del doppio strato nel canale ICAM uno in modalità turf M e widefield. Questo passaggio serve a confermare il legame di ICAM uno sul doppio strato rivestito con nichel rispetto al doppio strato privo di nichel. La camera a flusso è ora pronta per ricevere le cellule.

Per questa dimostrazione, utilizzeremo cellule T trasfettate con un retrovirus contenente il recettore per cellule T transgenico ND che codifica per GFPs P zap 70, lavando le cellule una volta con H-B-S-H-S-A e quindi incubando le cellule con un FAB marcato con Alexa 568 diretto contro il recettore per cellule T, in modo da poter tracciare i microaggregati del TCR. Dopo 15 minuti, diluire le cellule di uno a dieci. Questa diluizione riduce la concentrazione dell'anticorpo H 57 a sufficienza per evitare interferenze con l'immagine del turf M, ma mantiene la saturazione del recettore per cellule T mentre il fab inizialmente legato inizia a dissociarsi, quindi iniettare le cellule nella camera di flusso.

Immaginiamo la sinapsi immunologica in modalità turf M a tre colori. Questo include la formazione dell'interazione LFA-1, ICAM-1, la formazione di aggregati di TCR e della C smac e la formazione sostenuta di microaggregati di TCR, che reclutano GFP ZAP-70. Alcuni di questi risultati sono evidenti durante l'acquisizione, mentre altri richiederanno un'analisi post-acquisizione per essere pienamente apprezzati.

Ok, abbiamo appena mostrato come utilizzare bilayer piani supportati per studiare la sinapsi immunologica. È molto importante, affinché questi esperimenti funzionino, che le cellule T siano in ottime condizioni e che la soluzione salina tampone PPS non sia utilizzata per colture a lungo termine delle cellule T. Pertanto, è necessario prelevare le cellule dalla coltura, trasferirle in questo mezzo e utilizzarle rapidamente.

Se si desidera effettuare esperimenti a lungo termine, esistono alcune ottime formulazioni di mezzi privi di siero che è possibile sostituire al salino tamponato con he. Questi mantengono le cellule in vita molto più a lungo, qualora si vogliano eseguire analisi a tempi più lunghi, come la produzione di citochine o la proliferazione delle cellule T. È tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.