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20世紀初頭には、肺炎は感染症による死亡の大部分を占めていました1。肺炎に対する効果的なワクチンを開発するために、フレデリック・グリフィスは、肺炎球菌の2つの異なる株、すなわち、粗い外観の非毒性株(R株)と、外側の多糖類カプセル2による滑らかな外観の毒性株(S株)の研究に着手しました。このS株細菌の外層により、彼らは宿主の免疫系に耐えることができ、最終的には生命を脅かす病気につながりました。グリフィスがマウスにどちらかの系統の熱死菌を別々に注射したとき、マウスは生きました。しかし、彼がマウスに熱死させたS株と生きたR株の組み合わせを注射したとき、マウスは死にました2。この組み合わせを注入した死マウスから得られたサンプルを分析したところ、生きたS株細菌が存在することが観察されました。1928年、グリフィスは、非毒性の細菌を毒性のある株に変えるために「形質転換」プロセスが起こったに違いないと述べました。細菌の形質転換に関する最初の発見として知られている彼の発見は、遺伝子工学における重要なツールである形質転換3の開発への道を開きました。
形質転換とは、環境からのDNAの摂取による細胞内の遺伝的変化です。グリフィスの実験では、S株細菌の保護多糖類コーティングをコードするDNAが熱ショックで分解されず、R株に導入されたため、R株はマウスの免疫系をバイパスすることができました。このプロセスは、野生では生物と異なる種の間で常に発生しますが、科学者は研究目的で実験室で細菌を変換します4。
細菌は、外因性の遺伝物質を容易にゲノムに取り込み、それを急速に増幅できるため、形質転換に理想的な生物です3,5。それらは、細胞質内に1つの環状染色体とプラスミドと呼ばれる複数の小さな環状DNA片を持っています。これらのプラスミドは、染色体DNAとは独立して複製することができ、一般に、抗生物質に対する耐性などの特定の機能的利点を提供する6,7。自然環境では、細菌はコンジュゲーション8と呼ばれるプロセスで他の細菌からプラスミドを取り込むことにより「細菌の形質転換」を行います。さらに、それらが増殖すると、それぞれの子孫は新しいプラスミドのコピーを受け取ります。
実験目的で使用されるプラスミドは、プラスミドベクターと呼ばれます。実験室では、DNA断片をプラスミドベクターに挿入することにより、科学者は約5,000〜10,000塩基対の長さの「組換えプラスミド」を人工的に作成できます。これらの組換えプラスミドには通常、複製起点(ORI)、抗生物質耐性遺伝子、マルチクローニング部位、プロモーター、選択マーカー、目的遺伝子などの特定の要素があります。レプリケーションの起点は、レプリケーションが始まるところです。抗生物質耐性遺伝子は、プラスミドを取り込んだ細菌が、特定の抗生物質薬の存在下でプレート上で生存することを可能にします。プラスミドはDNAの比較的小さな断片ですが、科学者はプラスミドが細胞膜を貫通できるように宿主細胞を処理する必要があります。したがって、形質転換の効率は、ホスト膜の多孔性に直接関係しています。 一般的なアプローチの1つは、塩化カルシウム溶液9で処理された細菌にヒートショックを与えることです。プラスミドを取り込まない細菌は形質転換しないため、プレート上で生存して見える抵抗力はありません。複数のクローニングサイトは、目的の遺伝子を挿入してライゲーションできるプラスミドを切断するための制限酵素の部位を含むことにより、DNA挿入を支援します。プロモーターは、目的の遺伝子の転写を促進します。これは、マーカー、通常は緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質によってタグ付けされるか、または追加の抗生物質耐性遺伝子である可能性があります。抗生物質耐性遺伝子やその他の選択マーカーは、採取した細菌に目的のプラスミドが含まれているかどうかを判断するのに役立ちます。
効果的な形質転換法により、科学者は遺伝子と遺伝子産物を分離してプロファイリングすることができ、効果的な医薬品の開発、遺伝子組み換え作物の生成、高度な診断ツールなど、ライフサイエンスと医学に多くの進歩をもたらしました10。 さらに、技術の進歩に伴い、新しい変革の方法が出現しています。例えば、Gateway Cloningは、複数のDNA断片を異なるベクターに挿入するだけでなく、プラスミド間でのDNA配列の転写を可能にする11。さらに、clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-Cas9は、ゲノム内のヌクレオチドを直接修飾する遺伝子編集技術であり、プラスミドの使用を必要としない12。形質転換後、研究者はしばしば目的の遺伝子とその産物を単離し、プロファイリングします。その結果、遺伝子クローニングの全プロセスが、遺伝子操作の新しい分野を切り開きました。遺伝子クローニングのおかげで、研究者は細菌を操作して、糖尿病患者を治療するためのインスリンなどの特定のヒトタンパク質を大量に生成することができます10。クローニングは、現代の農業においても大きな役割を果たしています。遺伝子組み換え生物(GMO)は、遺伝子クローニングと細菌の形質転換の直接的な結果である10。例えば、科学者たちは、窒素固定遺伝子をゲノムに組み込んだ遺伝子組み換え作物を作製して、食料生産を促進し、肥料の使用を減らし、肥料の経済的および環境的影響を減らすことに取り組んでいます13。要するに、細菌の形質転換は、現代のバイオテクノロジーの第一歩であり、将来の研究発見の基盤です。
20世紀初頭、フレデリック・グリフィスというイギリスの細菌学者が、肺炎の原因となる細菌Streptococcus pneumoniaeを研究していました。彼は2つの異なる株を使用して簡単な実験を行いました。1つの株は、それが形成するコロニーまたは塊を滑らかに見せ、またそれを毒性または有害にする保護カプセルのためにS株として知られています。2つ目はR株で、細菌が保護カプセルを欠いているため、コロニーに粗い外観を与え、毒性がなくなります。
まず、グリフィスはS株のバクテリアの一部を採取して加熱し、S株の熱死バージョンを生成しました。そして、数匹のネズミを集めて4つのグループに分けました。彼は最初のグループに毒性のあるS株を注入し、2番目のグループに非毒性のR株を注射しました。彼は、第3のグループに熱死したS株を投与し、最後に、熱死したS株とR株を一緒に組み合わせて、この混合物を第4のグループに注入した。予想通り、第1グループのマウスは死に、第2グループと第3グループのマウスは生きました。しかし、グリフィスが驚いたことに、最後のグループのマウスも死んでしまいました。
彼が1928年に彼の研究を発表したとき、彼はこの神秘的なプロセス変換を呼びました、なぜなら彼は、以前は毒性がなかった株が致命的になることを可能にした根本的な変換原理の存在を推測したからです。その後、1943年に、アバート、マクラウド、マッカーティは、この変換原理がデソキシリボ核酸、またはDNAである可能性が高いと報告しました。基本的にグリフィスの実験で起こったことは、バクテリアが結合すると、熱で殺されたS株から一部のDNAがR株細胞に漏れ出し、これらの非毒性のバクテリアを変換し、情報を伝えて保護カプセルを作り、R株を毒性のあるものに変わり、4番目のグループの動物を殺すことができるようになったというものでした。
今日まで早送りすると、科学者たちは、細菌大腸菌とプラスミドと呼ばれるDNAの小さな環状ループを使用して、細菌の形質転換を研究するはるかに簡単な方法を開発しました。通常、形質転換実験で使用されるプラスミドには、抗生物質耐性などの特別な機能を持つ遺伝子が含まれています。大腸菌は、環境からDNAを取り込む能力である能力と呼ばれる特性を示すことができるため、形質転換の優れた対象です。基本的に、これは、化学物質や電気ショック、熱ショックなどの特定の環境条件下で、E. coliの細胞壁が一時的に透過性になり、環境からのDNAの取り込みを可能にすることを意味します。プラスミドが大腸菌の中に入ると、新しい宿主細胞の細胞質にたむろしてゲノムと共に複製され発現するか、宿主のゲノムに完全に組み込むことができます。細菌がいずれかの時点でプラスミドを失うと、細胞は抗生物質耐性も失うため、科学者は抗生物質を含む培地で細菌を増殖させ、目的のプラスミドを含むものだけが生存者になるようにします。
このラボでは、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを用いて、無菌の微生物学的手法を実践しながら、大腸菌細胞を形質転換する方法を学びます。
