DNA単離および制限酵素解析
- DNA分離
- 注:この実験では、洗剤SDSを含むバッファーを使用したものと洗剤を含まないものの2つの実験条件下でDNA単離を行います。仮説: この実験の別の仮説は、細胞膜を分解する強力な陰イオン性洗剤である SDS なしで調製したサンプルは、SDS で調製したサンプルよりも DNA の産出量が少ないというものかもしれません。この実験の帰無仮説は、両方のサンプルから同量のDNAが得られるというものかもしれません。
- DNA分離のための組織サンプルの収集を開始します。ここでは、自分の頬の細胞を使用します。アイスキャンディースティックを使用して、頬の内側を約30秒間こすり落とします重要:痛みを引き起こしたり、血を流したりするほど強くこすらないでください。
- 15mLの円錐形チューブに漏斗を配置します。
- 次に、付属の1%生理食塩水10mLをラベル付きのカップに入れ、飲み込まずに口の中で振り回します。
- 90秒間スウィッシュを続けてから、頬の細胞を含む生理食塩水を漏斗に吐き出して円錐形のチューブに集めます。
- 次に、2本の空の微量遠心チューブにあなたのイニシャルをラベル付けします。
- チューブの1つを+SDSとしてラベル付けし、もう1つを-SDSとしてラベル付けして、2つの治療を区別します。
- 次に、頬の細胞を含む生理食塩水を各チューブに1.5〜2mL加えます。
- マイクロ遠心分離機でチューブを30秒間回転させます。
- マイクロ遠心分離機からチューブを取り外し、各チューブの底に集まった細胞を乱さずに上清を慎重に注ぎます。
- 頬の細胞を含む生理食塩水をチューブにさらに充填し、遠心分離を繰り返します。
- このプロセスを繰り返し、+SDSチューブと-SDSチューブの間に細胞を均等に分散させ、すべての頬の細胞が採取されるまで続けます。
- 次に、+SDSとマークされたチューブにSDSを含む溶解バッファー1mLを追加し、ピペッティングで上下させて細胞ペレットを再懸濁します。
- 次に、-SDSとマークされたチューブにSDSなしの溶解バッファー1mLを加え、ピペッティングで上下させて細胞ペレットを再懸濁します。
- この後、各チューブに10μLのプロテイナーゼKを加え、チューブを56°Cのウォーターバスに10分間慎重に置きます。
- 10分後、チューブを慎重にウォーターバスから取り出し、各チューブに100μLの2.5M NaClを加えます。
- チューブをしっかりと閉じ、数回反転させて混ぜます。
- 次に、1つの15mLコニカルチューブに+SDSとラベルを付け、もう1本に-SDSとラベルを付けます。
- 各微量遠心チューブの内容物を対応する15mLの円錐形チューブに注ぎます。
- 冷凍庫から100mLエタノールの10mLアリコートを1つ入手します。
- 円錐形のチューブの1つを斜めに保持し、100%エタノール1mLをチューブにゆっくりと分注して、チューブ内にすでに液体の上に層を形成します。
- 2番目の円錐形のチューブに対してこのプロセスを繰り返します。
- 次に、両方のチューブを見てください。エタノールとその下の水層の界面に糸状の沈殿物が存在するはずです。この糸状の材料には、単離されたDNAが含まれています。チューブ内のDNAの写真を撮り、観察結果をノートに明確に記述し、描画します。
- ガラス攪拌棒を使用して、+SDSチューブからDNAをピックアップして調べます。これを-SDSチューブに対して繰り返し、観察結果を再度記録します。一方のチューブがもう一方のチューブよりも沈殿物が多いように見えるかどうか、およびなぜそうなるのかに注意してください。
- 最後に、すべての液体廃棄物を適切な廃棄物容器に捨て、すべてのツールをラボの適切な場所に戻します。
- 制限酵素バーチャルダイジェスト
- 制限酵素の働きを研究するには、まずNew England Biolabsのウェブサイトにアクセスしてください。https://www.neb.com/
- このサイトで利用可能なリソースにより、研究者はラボで実施する前に仮想実験を行うことができます。「ツールとリソース」をクリックしてNEBcutterツールを見つけ、プログラムを開きます。
- 検索ボックスの右側に「ウイルス+ファージ」と書かれたリストを見つけます。そのリストから [Lambda] を選択します。これは、あなたが消化するDNAの名前です。ツールが「配列は」と表示されている場合は「Linear」オプションを選択し、ツールが「使用する酵素」と表示されている場合は「NEB enzymes」オプションを選択します。次に、[送信] をクリックします。
- 次のページには、ラムダDNAの完全な制限マップが表示されます。この制限マップは、特定の酵素を使用した場合に何が起こるかを予測するために使用できます。次に、「メインオプション」の見出しの下にある「カスタムダイジェスト」をクリックします。
- 酵素StuIを検索し、それがバッファー2.1またはCSバッファーで最適に機能することに注意してください。StuI酵素を選択し、ダイジェストをクリックします。
- 次のウィンドウで、「Main options」ヘッダーの下の「View gel」をクリックしてください。pBR322-BstN1消化物を使用して仮想1%ゲルを泳動するオプションを選択します。
- 結果が表示されたら、スクリーンショットを撮って空白のドキュメントに貼り付けます。
- この後、NEBcutterツールのメインページに戻り、「新しいカスタムダイジェスト」を選択します。
- 今回はBsrGI酵素を検索し、バッファー2.1またはバッファー3.1で最適に機能することに注意してください。酵素を選択し、ダイジェストをクリックします。
- Main optionsヘッダーの下の「View gel」をクリックし、pBR322-BstN1ダイジェストを使用して仮想1%ゲルを実行するオプションを選択します。
- 結果のスクリーンショットを撮り、これをテキストドキュメントに保存します。
- 最後に、StuIとBsrGIの両方を一緒に使用して、これらの手順を1つのダイジェストで繰り返します。
- 再度、スクリーンショットを撮り、得られたゲルを保存します。
- DNAプロファイリング
- 制限酵素消化を開始する前に、まずラムダDNA、NEBバッファー2.1、StuI酵素、BsrGI酵素のアリコートを氷のバケツに入れ、これを作業エリアに持っていきます。
- チューブにStuIのラベルを付けます - これにはStuIダイジェストが含まれます。
- チューブにBsrGIのラベルを付けて、BsrGIダイジェストを格納します。
- 次に、チューブS+Bをラベル付けして、両方の酵素を含む消化物を封じ込めます。
- 適切なマイクロピペッターを使用して、表1にリストされている反応を設定してください：表1をダウンロードするにはここをクリックしてください
- まず、40μLの水を各チューブにピペットで入れます。
- 次に、毎回新しいピペットチップを使用して、5μLのバッファー2.1を各チューブに分注し、ピペットを上下に動かして混合します。
- 次に、各チューブに4μLのラムダDNAを追加し、次に各酵素の0.5μLを適切なチューブにピペットで入れます。
- 最後に、各チューブに十分な量の水を追加して、総容量を最大50μLにします。
- 次に、チューブを37°Cで15〜60分間水浴でインキュベートし、バッファーと酵素を冷凍庫に戻します。
- 消化物を実行するためのアガロースゲルを準備するには、250mLのフラスコに1gのアガロース粉末と100mLのTAEバッファーを混ぜます。
- 溶液が沸騰しないように注意しながら、溶液をフルパワーで約90秒間電子レンジで加熱します。
- 次に、手袋またはヒートパッドを使用して電子レンジから溶液を慎重に取り出し、約15分間冷まします。
- アガロース溶液が冷える間、キャスティングトレイを設置します。
- アガロース溶液が冷えたら、溶液に10,000X SYBR Safeゲル染色剤を5μL加えます。
- ゲルのウェルを作るために使用されるコームをゲル電気泳動装置のキャスティングトレイに追加します。
- アガロースゲル溶液をキャスティングトレイに注ぎ、固化させます。
- ゲルが固まったら、コームをまっすぐ上に引っ張ってゲルから取り出し、必要に応じてキャスティングトレイからダムを取り外します。
- ウェルが負極または黒色電極に最も近い位置にある電気泳動チャンバーにゲルを置き、チャンバーに1x TAEバッファーを充填してゲルを完全に覆います。
- サンプルをウォーターバスから取り出します。
- 次に、各サンプルに8.3μLの6倍ローディング色素を加えます。
- 既知のサイズのDNA断片を含むpBR322-BstN1消化物10μLを最初のウェルに分注します。
- 次に、25μLのサンプルStuIを2番目のウェルにロードします。
- 25μLのサンプルBsRGIを3番目のウェルに入れます。
- 25μLのサンプルS+Bを4番目のウェルにロードします。
- ゲルを動かすには、リード線を電気泳動チャンバーに差し込み、次に電源に差し込みます。赤色の正のリード線は井戸から最も遠い端に、黒色の負のリード線は井戸に最も近く配置する必要があります。これは、サンプルが陰性から陽性に実行されるためです。
- 電源を入れ、ゲルボックスを170ボルトで約60分間動作するように設定します。
- 実行が完了したら、ゲルボックスの電源を切り、電極をタンクから外します。
- 次に、電気泳動チャンバーからゲルを取り出し、UVトランスイルミネーターで観察します。 注意: ゴーグルを着用するか、付属のシールドを使用して、紫外線から目を保護してください。
- 最後に、携帯電話のカメラを使用して、ゲルの表面に平行に真上からゲルの写真を撮ります。
- 結果
- ラボで使用したゲルを、StuIで仮想酵素消化と比較します。
- StuIによる仮想ダイジェストは7つのバンドをもたらしました。ゲルのStuIレーンのバンドを数え、これが仮想消化物と一致したか、または同様のパターンを示しているように見えたかを記録します。注:アガロース電気泳動ゲル上の小さなバンドは、多くの場合、目に見えません。
- 次に、BsrGIダイジェストの結果を見てください。BsrGIによる仮想ダイジェストの結果、6つのバンドが生成されました。BsrGIレーンのバンドを数えます。ここでも、仮想ダイジェストとラボダイジェストが同じパターンを示したか、類似したパターンを示したかに注意してください。
- 最後に、StuIとBsrGIを使用した仮想ダイジェストを見てみましょう。両方の酵素による仮想消化物の結果、12バンドが得られました。ゲルの対応するレーンのバンドをカウントし、DNAバンディングパターンが仮想消化物と類似しているかどうかを検討します。
Q1: Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?
SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.
Q2: What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.
Q3: How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?
Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.
Q4: What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?
Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.
Q5: Why are different buffers required for different restriction enzymes?
Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.
Q6: How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?
DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.
Q7: What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?
Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.