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DNAがすべての生物の遺伝分子であることの解明は、科学と医学の大きな進歩をもたらし、自分自身や他の生物に対する私たちの理解を著しく高めました。DNAの単離とプロファイリングは、前世紀の多くの進歩の基本的な第一歩でした。遺伝子機能の同定から、農業や法医学の革命まで。
DNAの単離は、細胞の回収、溶解、タンパク質の分解、そして最後にDNAの沈殿という、いくつかの重要なステップを必要とする非常に単純な手順です。一般に、DNAは、植物の一枚の葉、動物の毛包、上皮細胞など、単純な生理食塩水で口の中で簡単に剥がすことができる少量の組織から採取できます。DNAは真核細胞内の核またはミトコンドリア内で区画化されているため、科学者は最初に細胞と核膜を分解してDNAを露出させます。しかし、DNAが露出すると、重金属イオンや極端なpHによって劣化する可能性があります。そのため、界面活性剤含有緩衝液は、細胞膜を溶解するだけでなく、溶液中の分解要素からDNAを保護するためにも使用されます。さらに、DNAは異常に長い分子であり、ヒストンと呼ばれる特殊なタンパク質の周りに密集することにより、核内に凝縮されています。そこで、タンパク質のペプチド結合を分解するプロテイナーゼKという酵素を付加して、ヒストンや他のタンパク質からDNAを分離します。次に、科学者は、その化学的特性を使用して、細胞抽出物の残りの部分からDNAを分離します。核酸の負に帯電した構造により、塩化ナトリウム溶液中のNa+イオンは、絡み合ったDNA鎖に結合して統合します。DNAが凝集すると、肉眼で観察できます。DNAはアルコールに不溶で、低温で容易に沈殿するため、科学者は冷たいアルコールを加えてDNAを沈殿させます。最後に、沈殿したDNAは、核酸を分解する可能性のある酵素を含まない脱イオン水またはマイルドバッファーに溶解して保存することができます。
DNAを使用する反応では、多くの場合、高純度で正確な量のDNAが必要です。したがって、DNA単離後、科学者は分光光度計を使用して、サンプル中のDNAの量とサンプル中のDNAの純度を定量化します。分光光度計は、サンプルを通過する光ビームの強度を、その波長の関数として測定します。核酸は260nmで光を吸収し、タンパク質は280nmで光を吸収します。260nmの光ビームの強度を測定することで、科学者はDNA濃度を決定できます。さらに、260 nmと280 nmの両方で光強度を評価することにより、DNA含有量の純度を決定できます。純粋なDNAのサンプルでは、260/280 nmの比率は2の値に近づくはずです。
クローニング、シーケンシング、DNAフラグメントやゲノムのマッピングなど、多くの解析では、制限酵素を使用して単離されたDNAを特定の配列で切断する必要があります。これらの酵素は、侵入したウイルスDNAに対する自然免疫のメカニズムとして細菌によって産生され、分子のはさみとして機能します。したがって、制限酵素はウイルスDNAを同定した後、認識する特定のヌクレオチド配列でセグメントに切断することにより、ウイルスDNAをバラバラにし始めます。これらのヌクレオチド配列は、多くの場合、6〜12ヌクレオチド長で、一般に回文性であり、これは、3'-5'および5'-3'方向に同じヌクレオチド配列を有することを意味する。例えば、制限酵素EcoRIは、配列3'でDNAを切断します...GAATTC...-5' は 5'-3' 方向で同じ読み取りを行います。EcoRIと同様に、多くの異なる回文配列に対応する何百もの酵素があります。これらの酵素によってDNAが切断されると、科学者はDNAを電気泳動チャンバー内のゲルにロードし、ゲルに電流を流すことができます。DNAは負の電荷を持っているため、DNA断片がアノードに向かって移動します。しかし、ゲルの細孔は、小さなDNA配列に比べて大きなDNA断片を遅くするため、断片はそのサイズに応じて分離します。電気泳動の完了後、DNA分子に特異的に結合する色素を用いてDNA断片を可視化することができます。
制限酵素でDNAを切断し、電気泳動でDNA断片を分離することで、研究者は標準的なラダーと比較して未知の断片のサイズを特定できます。これらの目的のフラグメントは、さらに単離し、遺伝子クローニングのためのプラスミドベクターにライゲーションすることができます。これらの方法により、遺伝子工学と実験室での分析は大幅に改善されました。DNAプロファイリングにより、科学者はゲノムの配列を解読して生物の働きをさらに理解することができ、特定の遺伝子1を特定して特徴付けすることもできます。
DNAの単離とプロファイリングは、日常生活に直接影響を与えるイベントにも実用的です。例えば、法医学者は、刑事事件や民事事件の証拠を提供するために、日常的にDNAサンプルを分析しています2。同様に、医療従事者はDNAを抽出して分析し、父子病や遺伝性疾患をチェックします。最近、DNA祖先分析キットは、ユーザーが自分の遺伝的系統を特定し、親戚を見つけ、さらにはさまざまな健康状態に対する遺伝的素因を発見することができることで人気を博しました3。最後に、バイオテクノロジーと遺伝子工学の進歩により、個別化医療は、個人の遺伝子データを使用して治療法を開発する臨床研究者の間で勢いを増しており、有害な副作用なしに患者を効果的に治療する道が開かれています4。
DNA抽出とは、細胞からDNAを除去して精製することです。まず、細胞は溶解されます-壊れて開きます-通常は、物理的な混乱と化学物質(細胞と核膜を溶解する洗剤など)による処理の組み合わせによって行われます。SDSまたはドデシル硫酸ナトリウムは、これらの膜を構成するタンパク質と脂質を可溶化することによって機能する一般的に使用される洗剤です。その後、内容物は周囲の溶液に自由に浮かぶことができます。
次に、DNAは存在する他の分子から分離する必要があります。反応に添加されたプロテイナーゼKは、ペプチド結合を分解し、汚染タンパク質を消化します。次に、塩をサンプルに添加すると、DNAの骨格内の負に帯電したリン酸基が安定化し、氷冷アルコールを添加した後、DNAが溶液から沈殿します。白い沈殿物は、遠心分離機で回転させ、チューブの底に沈殿させることによって収集されます。洗浄して緩衝液に再懸濁した後、抽出されたDNAは最終的に研究やバイオテクノロジーアプリケーションで使用できます。
DNAフィンガープリント法など、特定のDNAの新規パターンを特定できるバイオテクノロジーアプリケーションには、制限酵素の使用が含まれます。制限酵素は、DNAと相互作用し、特定の配列を認識する分子です。特定の部位が特定されると、DNAを切断します。これにより、ストランドが1つ以上の直線状に切断されます。抽出されたDNAがプラスミド、つまり細菌に最も多く見られるDNAの環状片であった場合、切断するとDNAは線状フラグメントを形成します。異なる制限酵素は異なるDNA配列を認識するため、これらを組み合わせて使用すると、異なるフラグメントが生成される可能性があります。
DNAフィンガープリント法では、DNAまたはゲル電気泳動と呼ばれる技術を使用してこれらのフラグメントを調べることができます。ゲルを調製するために、粉末アガロースを緩衝液と混合し、溶解するまで加熱する。次に、ヌクレオチド染色を温かい混合物に加え、この溶液を鋳造型に注ぎます。櫛を挿入してウェルを形成します。固化したら、ゲルをバッファーで満たされたゲルボックスに移し、コームを取り除きます。既知の長さの染色されたDNA断片の参照混合物であるDNAラダーを1つのウェルに加え、目的の染色されたDNAサンプルを残りのウェルにロードします。ボックスは電源に接続されており、電源を入れると、DNAヌクレオチド中の負に帯電したリン酸基がゲルを介してアノード(正端)に向かって移動します。小さな破片は、移動が困難な大きな破片よりも速く移動します。
ランが完了したら、ゲルを紫外線にさらして、DNAサンプル中のヌクレオチド染色を視覚化します。それらの存在は、はしごバンドに対する相対的な位置に基づいて確認できます。配列が異なるDNAは、異なる場所に切断部位を持つため、新しいバンドパターンやフィンガープリントが生成され、これを使用して個体や変異DNAプロファイルを区別できます。
このラボでは、SDSの有無にかかわらずバッファーを使用してDNA抽出を行い、DNA単離における界面活性剤の重要性を評価し、さまざまな制限酵素でプラスミドDNAを消化して、得られたDNAプロファイルを調べます。
