ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュは、長く生きて透明な胚のタイムラプスイメージングが開発中の細胞および分子メカニズムを研究するために利用されている。ここでは、長期的なイメージングのためのゼブラフィッシュ胚をマウントする方法を説明し、共焦点顕微鏡を用いたタイムラプス画像のキャプチャを自動化する方法を示します。我々はまた、二光子顕微鏡に搭載されたフェムト秒レーザーの集光力を用いてゼブラフィッシュの末梢感覚軸索の個々の枝に制御された、正確なダメージを作成する方法を説明します。成功した二光子軸索切断のためのパラメータは、それぞれの顕微鏡用に最適化されている必要があります。我々は二つの例を提供するためにカスタムされた2光子顕微鏡とツァイス510共焦点/二光子の両方で二光子軸索切断のデモンストレーションを行います。
ゼブラフィッシュの三叉神経感覚ニューロンは、感覚神経特異的プロモーター1によって駆動トランスジェニックラインを発現GFPで可視化することができる。我々は直接ゼブラフィッシュ胚の生体内での感覚軸索再生を観察するためにこのゼブラフィッシュの三叉神経モデルを適応している。それが固化すると胚はtricaineで麻酔し、アガロースのドロップ内に配置。固定された胚は、フェニルチオ尿素（PTU）リンガーズで満たされたイメージングチャンバー内に封入されています。我々は、胚が連続して12から48時間のためにこれらのチャンバーでイメージングできることを見出した。単一の共焦点イメージは、軸索切断の目的のサイトを決定するためにキャプチャされます。関心領域は画像処理による2光子顕微鏡の低、非損傷電力下感覚軸索に位置しています。軸索切断の目的のサイト上で拡大した後、電力が増加し、その定義された領域の単一のスキャンでは、軸索を切断するのに十分です。複数の場所タイムラプスイメージングは、直接、負傷から軸索の回復を観察するために共焦点顕微鏡に設定されています。
プロトコル
パート1：長期的イメージングのための取付ゼブラフィッシュ胚
- 埋め込みのために1％低融点アガロース溶液を調製。小さなチューブと摂氏42度で加熱ブロックのストアに分注し、マイクロ波で加熱することにより、DI水でアガロースを溶解する。
- イメージングのための胚を選択して、静かにピンセットで離れて絨毛膜を引っ張って、そのchorionsを削除します。胚は、色素の形成を抑制するために22から24時間後に受精（HPF）で5％PTUリンゲル溶液中に配置することができます。これは、画像の明瞭度を改善し、感覚軸索の二光子axotomiesを行うために不可欠です。天然色素をフォームに許可されている場合、自家蛍光は、2光子顕微鏡の軸索をあいまいにしています。ゼブラフィッシュのためのソリューションは116 mMのNaCl、2.9 mMの塩化カリウム、1.8 mMのCaCl 2を 、そして5mMのHEPES、pH 7.2のが含まれているリンガー。
- PTUリンガーに〜0.02％tricaineを追加することにより胚を麻酔。動物は先に進む前に触れないように応答していないことを確認してください。
- ガラスまたはテフロンリングの片側に真空グリースを塗布し、ガラス製カバースリップの上にそれを固定することにより、長期的なイメージング室を準備します。
- 多くPTUリンガーのを転送しないように注意しながら、ガラスピペットで42度アガロース溶液に1つの胚を転送して、準備カバースリップの上にアガロースの1滴で胚を移す。
- アガロースが固まるように必要に応じて胚を置きます。作業が終了したら、イメージングチャンバー、カバースリップが上面になるように反転されることに留意してください。
- あなたが電動ステージを持っているし、一度にできるイメージの複数の場所の場合、各胚のためのステップ1.4から1.6を繰り返します。
- 0.02パーセントtricaine PTUリンガーとリングをご記入し、アガロースが完全に固化することができます。
- スライドガラスにリング（s）をカバーして、リング（S）の反対側に真空グリースを塗布してください。以上の密閉室（s）を反転させます。これらのチャンバは、正立または倒立顕微鏡でのイメージングに使用することができます。
パート2：カメレオンのTi -サファイアレーザーを使用してカスタム構築された二光子顕微鏡を用いて二光子の軸索切断
- イメージングのための準備。顕微鏡下でスライドホルダーにマウントされている胚（s）を置きます。 40X（0.8 NA）水の目標と、ワン胚に焦点を当てる。レーザーをオンにします。我々は、再現性の視覚化と次のパラメータを使用して神経細胞の発現GFPを損傷することができた。非損傷力で軸索を可視化するために、910ナノメートルの波長（nm）と30の消費電力（mWのが記載されているサンプルでの電力量です）ミリワットにレーザーを設定します。イメージングソフトウェアを開きます。我々は、カレルヴォの研究室2、3で開発さscanimageでもソフトウェアを使用してください。
- 二光子レーザーで胚をスキャンにフォーカスを押して、あなたがaxotomize、そしてこの軸索の画像をキャプチャする軸索を探します。最初と最後のZ位置に印を付けて、画像を取得し、Zスタックの最大投影を行う。
- あなたがaxotomizeとスキャンを停止する軸索の枝上で70Xのズーム。 180 mWの有害な力にサンプルでmWを増やし、レーザーの単一のスキャンを実行します。我々は1にZスライスの数を設定して、"グラブ"を押すことによりこれを行います。これは、軸索を切断するには十分なはずです。あなたの顕微鏡や実験的な目標のためにこの手順を最適化するためのメソッドの説明を参照してください。
- ズームアウトするには、30mWのために電力を低減し、画像を取る。
パート3：ツァイス上の2つの光子軸索切断510共焦点/二光子顕微鏡
- 場所は、ステージに胚をマウントし、25X水の目的またはその他の適切な目標を使用してフォーカスにそれをもたらす。
- それは一方から他方に切り替えることが可能になるように、マルチトラックの設定では2光子（910 nm）とアルゴン（488 nm）のレーザーをオンにします。両方のレーザは、GFPを検出するために使用されていますが、二光子放出は、赤と可視化、そして緑とアルゴンレーザーの放射は、2つを区別する。
- けがに軸索を特定するためにアルゴンレーザーを使用してください。 Zの設定のもとで最初と最後の光のセクションをマーク。共焦点画像を取得し、Zスタックの最大投影を作成します。
- 負傷する軸索の地域を選択し、フォーカスにこの領域をもたらす。アルゴンレーザーの電源をオフにし、二光子レーザーをオンにします。軸索にフォーカスが残っていることを確認するために〜9％の透過のレーザー強度で二光子で試料をスキャンしてください。
- クロップツールが利用可能となるように"停止"ボタンをクリックしてください。関心の領域を拡大するために作物を使用してください。通常、我々は、〜70X（ズームは"モード"タブの下にチェックすることができます）にズーム。 "チャンネル"タブの下に15〜20％の伝送に〜9％の透過率からの二光子の強度を変更する。
- 軸索を切断するには、過剰なダメージを避けるために、停止ボタンを押して約1秒とするための"高速XY"ボタンをアクティブに。手順が動作すれば軸索は、散乱ゴミとして見られるべきである。
- その軸索を確実に488 nmのアルゴンレーザーに切り替える破損していた、別の共焦点画像を利用し、最大投影を作成します。
パート4：ツァイスLSM 510上に共焦点タイムラプスイメージング
- イメージングのための準備。あなたが加熱ステージを使用している場合は、あなたの早送り動画を設定する前に少なくとも30分にそれを投入してください。顕微鏡下でスライドホルダーにマウントされている胚（s）を置きます。必要な空気の客観的なワン胚に焦点を当てる。我々は20倍、0.5 NAの目的を使用してください。オープンツァイスLSM 510イメージングソフトウェア。適切なレーザーをオンにして、目的の構成を設定します。我々は今ツァイスLSMマルチタイムソフトウェアとの長期的なイメージングのための詳細なプロトコールについて説明します。これらのメソッドは、イメージングソフトウェアを使用して独自の顕微鏡での使用に適合させることができる。
- マルチタイムウィンドウ内の最初の胚の位置および設定を定義します。スキャン、ステージ、およびマルチタイムウィンドウを開きます。高速スキャンウィンドウにスキャンをアクティブにします。希望のXY位置にステージを移動します。スキャンウィンドウの最初と最後のZ位置をマークします。また、スキャンのウィンドウで、ミッドし、[停止]を押します。終了する中間のZスライスのスキャンを待って、その後段階のウィンドウでマークの位置を押してください。 、ある胚のみイメージングいる場合は、マルチタイムウィンドウで"単一の場所"タブをクリックします。 "置換XYZ"をクリックし、"設定を保存"。以前の構成を上書きするように要求するときに同意する。 4.4に進みます。あなたが機械化されたステージを持っていれば、画像の複数の胚への複数の場所を設定することができます。この場合、あなたは最初の場所のためにXYZと設定を定義する前に、"複数の場所"タブを選択してください。また、単に"複数の場所"タブの下のプルダウンメニューが位置1にあることを確認してください、そしてあなたが上で設定を保存]をクリックする前に構成セクションのプルダウンメニューは、locの1マルチと述べている。
- マルチタイムウィンドウ内に残っている胚の位置および設定を定義します。あなたの次の胚を見つけ、その後、高速スキャンを押して、目的のXY位置にステージを移動し、スキャンのウィンドウで、最初と最後のZ位置をマークします。また、スキャンのウィンドウで、ミッドし、[停止]を押します。終了する中間のZスライスのスキャンを待って、その後段階のウィンドウでマークの位置を押してください。 "XYZの置換"をクリックしてください。 "設定の保存"をクリックして、構成セクションのプルダウンメニューは複数のLoc 2と述べているだけで"複数の場所"タブの下のプルダウンメニューが位置2にあることを確認してください、と。以前の構成を上書きするように要求するときに同意する。残りの胚に対して、このプロセスを繰り返します。
- マルチのLocウィンドウで画像取得のためのパラメータを設定します。 "ブロックのリスト"セクションにあるGR - GLのオプションを選択し、[グループの繰り返しの希望数を入力してください。これは、共焦点は、それぞれの場所で画像を取得する回数です。 Parametersセクションで目的の待機間隔を入力します。これは、1つの画像の繰り返しの開始から次の繰り返しの開始までの時間の量です。構成セクションの"ZStackXY"を選択します。あなたに一番下のセクションのベースファイル名を入力してください。 "選択画像DB"をクリックして、mdbファイルを選択してください。 "オプション"ボタンをクリックします。一時ファイルを保存するMDBのフォルダを選択します。 "最終的な画像を保存"、および"Zスタックの中央"、"最終的なイメージを開いたままに"確認してください。間隔を待つ]を選択します。オプションウィンドウを閉じるには、[OK]をクリックします。 "開始時刻"をクリックしてください。イメージングの期間中、マルチタイムウィンドウは開いたままにしておきます。
- あなたのデータを分析する。タイムラプスイメージングが終了したときに、マルチタイムソフトウェアは、場所ごとにサマリファイルに一時ファイルをすべてコンパイルします。あなたはそれが完了する前にムービーを停止したい場合は、要約ファイルが作成されるように、代わりに"ストップ"の"Finish"を押してください。一時ファイルや要約ファイルが自動的に指定されたMDBのフォルダに保存されている必要があります。 LSMソフトウェアのメニューから、"投影"し、"3Dビュー"をクリックしてください。プルダウンメニューで選択してサマリファイルを使用して、"適用"をクリックしてください。これは、それぞれの共焦点画像のZスタックの最大の予測を生成します。 LSMソフトウェアのメニューで、"ファイル"をクリックし、"エクスポート"。 tifファイルのシリーズとして最大の突起を保存します。その後、ImageJでまたはQuickTime Proを使ってtifファイルは一連のムービーを作成することができる。 LSMの画像の軸索は軸索の形態に関する詳細な定量的な情報を生成するために画像解析ソフト（MicroBrightfieldからなどNeuroLucida）を用いて3次元的に追跡することができます。
パート5：代表的な結果
成功した実験は、細胞のダイナミックの正確な表現になります怪我からの軸索のsは回復。あなたの胚は、目に見える変性と強いビートで、イメージを作成した後、健康になります。軸索切断は軸索の定義枝を切断する、正確なダメージになるはずです。周囲の軸索と最小限の細胞死への傷害がないはずです。我々は直接実験の約50％の軸索切断のサイト上の単一表皮細胞の死を参照してくださいと信じています。あなたがより多くのダメージを観察する場合の議論で説明したように、あなたの二光子プロトコルを最適化する必要があります。
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ディスカッション
我々は正確に末梢感覚軸索をaxotomizeすると、直接生活ゼブラフィッシュの胚で再生を観察するために説明する方法を使用している。ゼブラフィッシュにおける長期タイムラプス共焦点イメージングは、 生体内で多くの発達過程を観察するために使用することができます。説明する2つの光子軸索切断の手順は、多くの異なる実験の目的のために変更することができます。我々は、細胞体ではなく末梢軸索の枝上のズームで、全体の三叉神経感覚神経の細胞体を除去するため、同じ一般的な手順を使用している。蛍光との識別可能な任意のセルのタイプは、正確に損傷またはフェムト秒レーザーの集光力でアブレーションすることができます。我々はパルスレーザは、局部的な損傷を作成したり、セル4,5,6を切除するために使用されたいくつかの他のシステムでこれまでの研究により、ゼブラフィッシュのシステムにこれらの技術を完璧に触発された。対照実験では、軸索切断が非常に正確であることを確認した：我々は、彼らが同じセルの枝である場合でも、近くに軸索を損傷していない、とたまにしか軸索に近い並置に上皮細胞を損傷することがありません。この特異性は、二光子レーザー励起の強度...
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謝辞
我々は議論をタイムラプスイメージングのための取付けに関するアドバイスはキャシージュバン、地元の組織の損傷を作成するには、二光子顕微鏡を用いて上での最初のアドバイスのためにマーク寺崎に感謝、そしてSagastiとPortera - Cailliauラボ。初期の実験は、ウッズホール、マサチューセッツ州の海洋生物学研究所のグラス財団のフェローとして、ASによって行われた。 Sagastiラボの仕事はホワイト財団、Klingenstein財団、生物科学におけるバローズウェルカム基金のキャリア賞からの補助金によって支えられている。
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参考文献
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