の調製ショウジョウバエ胚

サマリー

ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。

要約

緑色蛍光タンパク質（GFP）をベースボックスに追加ライブイメージングは​​、そのような組織の形態形成、細胞間接着、または細胞死などの動的過程の遺伝的調節を研究するための強力な手法です。 GFPを発現するショウジョウバエの胚は、容易にどちらかの立体または共焦点顕微鏡を用いて画像化している。あらゆるライブイメージングプロトコルの目標は、このような脱水や低酸素などの有害な影響を最小限に抑えることです。ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を調製するための以前のプロトコルは、ハロカーボンのオイルでdechorionated胚を配置し、ハロカーボンガス透過膜とカバーの間にそれらを挟む関与している

プロトコル

準備

1. 標準的なブドウジュース寒天プレート⁴の胚を収集する。それは自動化されたショウジョウバエの卵コレクタ（Flymax科学機器（株））を使用すると便利です。同期を使用すると、胚のコレクションが必要な発育段階で胚の適切な数値を得るために実行しなければならないdechorionationsの数を減らす予定上演。
2. 顕微鏡のスライドに両面テープの一部を添付してdechorionationのスライドを準備する。テープから裏紙を取り外します。
3. チャンバーのウェル中に収まるように組織片を切断することにより、ライブイメージング室を準備します。ウェル内の組織を配置し、蒸留水で濡らす。
4. 1:1の比率でハロカーボンオイル（ハロカーボン製品社）粘度のシリーズ700とシリーズ56を混ぜる。混合物は、保存され、無期限に使用することができます。
5. カバースリップ（22 X 40ミリメートル、第2号）の表面にハロカーボンオイルのいくつかの小滴を置きます。ボリュームは重要ではないが、20〜40μlの順で指定する必要があります。

手順

1. 実体顕微鏡の助けを借りて、どちらかの宝石商のピンセット（5番）や非常に細かいペイントブラシを使用して、グレープジュース、寒天プレートから胚を回収する。胚は、相互に及び鉗子"のヒントに固執する傾向があり、それらは簡単にまとまって集まっている。
2. 実体顕微鏡の助けを借りて、軽くdechorionationのスライド上のテープの表面に鉗子の先端に付着した胚の塊を下げる。
3. 再び実体顕微鏡を使用して、静かに内側の卵黄膜（卵黄膜が破裂している場合胚がバーストされる）を破裂させずに外側のワックス状の絨毛膜を開いて打開するために鉗子の面で胚を揺らす事や脳卒中。
4. 外側の絨毛膜が破裂した後は、絨毛膜から胚をいじめる。dechorionated胚は、鉗子の表面に付着する傾向があります。テープの表面にdechorionated胚を触れないように注意してください。
5. とすぐに胚がdechorionatedなので、すぐにカバースリップ上にハロカーボンオイルの予め調製したドロップに移す。ハロカーボンの油滴の表面にdechorionated胚を運ぶ鉗子の先端をタッチして - これは石油に鉗子から胚をdislodges。
6. 油滴の胚の転送を確認してください。これは、黒い背景上で動作し、斜めの角度で設定された光ファイバー照明の光源を使用していることが肉眼で行うことができます。
7. 別の胚をdechorionateを試みる前に、鉗子から任意の油をきれいに。油でコーティングされた鉗子はdechorionationをより困難に、絨毛膜の表面上に小さいものがある。
8. Dechorionated胚は、ハロカーボンのオイルで好調です。鉗子や絵筆を使用し、実体顕微鏡を通して見ながら、油滴の底面に胚を押してお好みのポジションに配置。
9. すぐにライブイメージングチャンバーの優に超えるカバースリップを反転。胚は、所望の方向にカバースリップに対して休んでいることを確認してください。油で彼らの浮力のために、胚はカバースリップの下面に対してフロートします。テープでライブイメージング室にカバースリップを修正。テープがカバースリップの端とライブイメージングチャンバーのウェルの端との間のギャップにまたがる地域にテープで穴をカットすることによりチャンバーを換気する。
10. 直立蛍光顕微鏡または蛍光実体顕微鏡は、現在のイメージ胚をするために使用することができます。

ディスカッション

我々は、ハンギングドロッププロトコルを呼び出すのライブイメージング解析、のために、ショウジョウバエの胚を作製する新しい方法を説明します。残念ながら、それは倒立顕微鏡を扱う場合ハンギングドロッププロトコルを使用することはできません。このケースで挟み込む技術が（上記の抽象的で説明したように）使用され、胚の圧縮は、懸念のままする必要があります。

セルの形状とサイズは形態形成運動に関連付けられている力を計算するために測定される実験では、正立顕微鏡やハンギングドロッププロトコルの使用は減少し胚の圧縮に望ましいおかげです。また、ハンギングドロッププロトコルを使用して減少した胚の圧縮は、挟む技法は平らな表面を提示するのに対し、胚のラウンド、歪みのない表面を提示の結果を持っています。共焦点顕微鏡を使用する場合、それは、したがって、挟持方法対ハンギングドロッププロトコルを使用している場合（スタックごとにさらに多くのスライス）より広いZ -スタックを収集することが必要です。 Z -スタックあたりのスライス数の増加は、しかし、レーザーの励起に関連するすべての写真毒性または光退色としてだけでなく、収集時間...

材料

顕微鏡スライド、カバーグラス（22 × 40ミリメートル、2号）、両面テープ、宝石商の鉗子（デュモンスタイル第5号：標準装備し、ハンギングドロッププロトコルを使用して、ライブイメージングのために胚を作成するために必要な材料は、以下の項目が含まれています）、ハロカーボンオイルシリーズ56とシリーズ700（ハロカーボン製品社）、ユーティリティナイフまたは単一のエッジのかみそりの刃、ティッシュペーパー、はさみ、蒸留水、汎用テープ、20〜40μlを配信するための適切なピペット。ライブイメージングプロトコルはまた、カスタムメイドのライブイメージングチャンバーを必要とします。この値は5 mmは標準的な顕微鏡スライド（75 × 25 mm）の寸法にポリカーボネートプラスチックシートを考えるとスライド（20 X 55 mm）を3mmの深いうつ病を作成するにはローターを使って切断することによって調製される。実体顕微鏡（顕微鏡を解剖）と光ファイバ照明用光源へのアクセスも必要です。