マウス副腎髄質クロマフィン細胞分離

サマリー

副腎髄質クロマフィン細胞培養システムは、in vitroの設定での興奮分泌連関の研究用に非常に便利です。このプロトコルは、副腎を解剖し、副腎皮質を離れて除去によって髄質領域を分離するために使用する方法を示しています。単一のクロム親和性細胞への髄質の消化は、示されている。

要約

副腎髄質クロマフィン細胞培養システムは、in vitroの設定での興奮分泌連関の研究用に非常に便利です。このプロトコルは、副腎を解剖し、副腎皮質を離れて除去によって髄質領域を分離するために使用する方法を示しています。単一のクロム親和性細胞への髄質の消化は、示されている。

プロトコル

略語：
ACCS - 副腎髄質細胞、E. Soln - 酵素液、E. DMEM - 充実したダルベッコ改変イーグル培地

1. 準備
   1. E. Soln（40単位パパイン/ 1ミリリットルE. Soln。）所望の量にパパインを追加。
   2. 氷上で約15分間carbogenとパパインをアクティブにします。だけでなく、氷の上に酸素を送り込むロックのバッファ。
      
2. 解剖
   1. 80〜10週のマウスを使用してください。
   2. 削除消化の前に氷の上でロックのバッファと場所を酸素。
   3. 解剖の手順については、ビデオを参照してください。
   4. かつて酸素ロックのバッファの場所の腺は、切り出した。
      
3. グランドの準備
   1. 腺からの脂肪を取り除きます。
   2. 腺から皮質を剥がします。
      
4. 酵素消化
   1. 滅菌フィルターは、パパインを酸素。
   2. シャーレに酸素パパインの4つのプールを作成します。
      1. 3つのプールは100uls程度でなければなりません。
      2. プールの1 400uls程度でなければなりません。
   3. プールを介して髄質を洗う
      1. 3 100ulのプールを介して第一。
      2. その後400ulプールを介して
      3. 微量遠心チューブに400ulプールからPippette 300ul E. Solnと髄質の部分。
      4. 37のマイクロ遠心チューブ及び場所に関するQrapパラフィルムで20分のための° Cの水浴。
      5. パパインを含む含酸素化合物、残りのE. Solnを継続することを忘れないでください。
      6. 20分後に滅菌フィルターよりE. Soln。
      7. 新たにフィルター処理されたE. Solnで古いE. Soln入浴髄質を交換してください。
         
5. Triturations
   1. 吸引とE. Solnを捨てる。
   2. 1ミリリットルE. DMEMで髄質を洗ってください。
   3. E. DMEMを吸引して捨てます。
   4. 1ミリリットル先端で300ul E. DMEMと粉薬20Xを追加。
   5. 滅菌かみそりの刃を持つ200ulの先端をカット。
   6. カット200ulチップで5 - 10Xひいて粉にする。
   7. E. DMEM入浴髄質の部分を捨てる。培地には、破片が含まれます。
   8. ピースを髄質に300uls新鮮E. DMEMを追加。
   9. 200ulチップ20倍でひいて粉にする
   10. Pippette E. DMEMはチューブwithough髄質の部分を遠心する。培地には、フリーACCSが含まれます。
   11. ピースを髄質に300uls新鮮E. DMEMを追加。
   12. 23.5ゲージの注射針20倍と髄質をひいて粉にする。
   13. 両方triturationsからE. DMEMを組み合わせる。髄質の部分はあってはならないと今featherlike外観を持つ必要があります。
       
6. メッキ
   1. 3.7グラムsで2.5分の最後の2つの粉砕のステップからマイクロE. DMEM
   2. その後の実験によって50uls - 200 E. DMEMでペレットを再懸濁します。
   3. プレートガラスのカバースリップ上で10 - 30uls。
   4. 付着する細胞を15分間待ちます。
   5. E. DMEMの750ulsを追加。