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3齢幼虫ショウジョウバエの幼虫から成虫ディスクの解剖

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

このプロトコルは、3齢段階でのショウジョウバエの幼虫から成虫のディスクを切り離すために使用される解剖手法を示しています。言って後に組織を固定し、翼、足、そして目のディスクを削除するメソッドは、直接、その後の可視化のための顕微鏡スライド上に示されている。

本日は、ショウジョウバエの3齢幼虫から成虫原基を摘出する方法について説明します。3齢幼虫の原基は、さまざまな発生プロセスの研究に利用できます。私たちの研究室では、アポトーシスの過程を観察するために使用していますが、様々なタンパク質を発現させて解析することで、原基内で順次進行するあらゆる発生プロセスを研究することが可能です。そのために、いくつかの非常に重要なツールを使用します。まず、幼虫をディッシュから取り出すためのピッキングスティックです。次に、非常に重要なのが解剖用ピンセットで、解剖をスムーズに進めるために極めて鋭利である必要があります。次に、11番の外科用メスを使用して、頭部からディスクを取り除きます。その後、ディスクをVector Shieldを封入剤としてスライドガラス上に配置します。まず、3齢の *D. melanogaster* 幼虫を回収します。ここではピッキングスティックを使用して、バイアルの壁面から剥がしています。スティックを少し濡らしておくと、剥がれやすくなることがあります。そのままPBSの一滴の中に移してください。これで、3匹目の星状幼生が得られました。私は右利きですので、個体の頭を右に向けます。次に、掴む位置を確認するための指標をいくつか使用します。まずはこちらとこちらの気管の主部を確認します。そして、頭に近いこちらの位置に小さな横断面があります。まず、幼虫の頭部から体の3分の2ほど下のあたりをそっと掴みます。次に、右手でここにある横片の数ミリ後ろを掴み、幼虫の幅のおよそ半分まで指を入れるようにします。これでしっかりと掴めました。半分ほどまで進んだことがわかります。次に、右手で前方へゆっくりと引っ張ると、腸がすべて出てくるのが見えます。これで、体の主要部分は廃棄できます。ここに、口器に付着した成虫原基を含む頭部があります。原基を潰さないように口器を持って、新しいPBSの液滴へと移動させます。これで、固定済みの幼虫の頭部が準備できました。余分な組織をすべて取り除き、前と同様に口器で幼虫を掴むか、あるいはピンセットで解剖プレート上に押し付けます。口器は現在、左側にあります。さて、ここにあるのは不要な腸で、こちらに唾液腺があります。脂肪体などが付着している場合があります。不要なものは、特に一部のアッセイや染色の妨げとなる脂肪組織を重点的に、丁寧に取り除いてください。これで、洗浄済みの幼虫の頭部が準備できました。これで、体から切り離し、固定および洗浄を行い、不要な組織を除去した幼虫の頭部が準備できました。また、必要に応じて抗体染色（C2-tunnelなど）やその他の機能的染色などの処理も完了しています。これらの頭部をスライドグラス上に配置し、頭部から実際のディスク、すなわち口器を切り出す準備が整いました。それでは、今回は口器がこちら左側にあります。ピンセットを使って、スライドガラスに押し付けます。右手には、より精細な解剖に適した11番のメス刃を持っています。まず、中枢神経系（CNS）と視葉を取り除きます。ここにCNSがあり、2つの視葉があり、それに眼・触覚原基が付着しているのが分かります。視葉と眼原基の間にブレードを差し込み、ゆっくりと引っ張ることでCNSを取り除きます。すると、眼原基がこのように伸びてきます。これで、CNS（中枢神経系）と視葉が取り出せました。次に、CNSから切り離された2つの眼盤があります。ここから、基部を慎重に切断して引き離すことで、口器からこれらを取り除きます。いいですね、こちらに片方の眼触覚ディスク、そしてもう片方の眼触覚ディスクがあります。はい。そして、ここに翅ディスクが突き出ているのが見えます。ここでも同様に、基部を慎重に探し、切開して引き出します。このように、翅ディスクとそれに付随する脚ディスク、および少量の気管が見えます。翅ディスクに脚ディスクが付着しており、明らかに複数の脚ディスクが存在します。したがって、ブレードで軽く探ることで、さらに多くのディスクを見つけることができます。これでこの個体から見つかるディスクはすべてです。脚ディスクがさらにいくつかあります。

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JoVE Journal

Biology

生物学

University of California, Irvine (UCI).  このプロトコルは、3齢段階でのショウジョウバエの幼虫から成虫のディスクを切り離すために使用される解剖手法を示しています。言って後に組織を固定し、翼、足、そして目のディスクを削除するメソッドは、直接、その後の可視化のための顕微鏡スライド上に示されている。

3齢幼虫ショウジョウバエの幼虫から成虫ディスクの解剖

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