高純度の取得トキソプラズマオーシスト

サマリー

本研究では、分子生物学的解析および組織培養操作に適した、感染猫の糞便からT. gondiiオーシストを容易に精製するための改良CsCl法の開発について述べる

要約

Toxoplasma gondiiは、ヒトに広く感染する真正細胞内寄生の原虫病原体である。これは、食料や水を介して感染が広がる疾患のアウトブレイクと関連する、よく知られたアピコンプレクサ門原虫である。確定宿主はネコ科動物であり、そこで性的複製が起こり、非常に感染力が強く、環境中でも耐性を示すオーシストの発生をもたらす。感染は、汚染された肉に含まれる組織嚢子または土壌や水に存在するオーシストを経口摂取することによって起こる。健康な個体では通常無症状であるが、生涯にわたる潜伏感染となり、免疫が低下した場合には再活性化し、トキソプラズマ脳炎を引き起こして死に至る可能性がある。トキソプラズマに汚染された肉は、ヨーロッパや米国においてこれまで主な感染源であったが、動物の管理・飼育方法の改善や食品の取り扱い・加工プロセスの向上により、肉中のトキソプラズマ嚢子の有症率は著しく低下している1,2。それにもかかわらず、ヒトの血清陽転率は依然として比較的高いため、オーシストに汚染された土壌や水からの暴露が可能性として考えられる。実際、世界中で水を介したトキソプラズマ症のアウトブレイクが報告されており、環境中のオーシスト形への暴露が重大な健康リスクをもたらすという理論を裏付けている3-5。これまで、環境中におけるトキソプラズマオーシストの有症率に関する研究は、環境中のオーシストを検出するためのツールが不足しているため限られている5,6。これは主に、研究目的のために感染したネコから大量かつ高純度のトキソプラズマオーシストを効率的に精製するためのプロトコルが確立されていないことに起因している。本研究では、分子生物学的および組織培養的処理に適した、感染したネコの糞便からトキソプラズマオーシストを容易に精製する改良型CsCl法の開発について述べる7。T. gondiiヨーロッパおよびアメリカ合衆国では、これまで cyst が主な感染源であったが、最近の動物管理および畜産慣行の変化、並びに食品の取り扱いや加工手順の改善により、肉中の T. gondii cyst の有症率は著しく低下している。T. gondii肉中の嚢子^{1, 2}. それにもかかわらず、ヒトにおける血清陽性率は依然として比較的高く、卵嚢で汚染された土壌や水からの暴露が可能性としてあることを示唆している。実際、トキソプラズマ症の水系によるアウトブレイクは世界的に報告されており、環境中の卵嚢形態への暴露が重大な健康リスクをもたらすという理論を裏付けている。^3-5. これまでに、環境中の卵嚢のまん延度を理解するための研究は、環境中の卵嚢を検出するためのツールが欠如していることから、限定的であった5,6。 T. gondii水中や環境中のオーシストの存在に関する研究は、環境中のオーシストを検出するためのツールが不足しているため、限定的である^{5, 6}。これは、多数の高純度のT gondii感染された猫からの研究用卵嚢。本研究では、感染した猫の糞便から容易にトキソプラズマ卵嚢を精製する改良型CsCl法の開発について述べる。T. gondii感染した猫の糞便から得られ、分子生物学的および組織培養的操作に適したオーシスト⁷.

プロトコル

1. T. gondiiオーシストを取り扱う際の一般的な安全上の注意事項

1. T. gondiiオーシストを扱う際は、すべての安全上の注意事項に従うことが重要です。ほとんどの健康な個人において、T. gondii感染は免疫系によって容易に制御されますが、生涯にわたる感染が残ります。免疫不全の方は特にトキソプラズマ症にかかりやすく、T. gondiiオーシストを扱うべきではありません。また、感染により深刻な出生欠損を引き起こす可能性があるため、妊婦の方もT. gondiiオーシストを扱うべきではありません⁸。
2. T. gondiiオーシストは、指定された区域で、訓練を受けた人員のみが扱う必要があります。指定区域に入る他の人に知らせるため、T. gondiiオーシストの作業中であることを示す標識を掲示しなければなりません。
3. T. gondiiオーシストを扱う際は、実験衣、使い捨てガウン、使い捨て手袋、および適切な保護メガネまたはフェイスシールドなどの適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。
4. 手袋は頻繁に交換することが推奨されます。T. gondiiオーシストで汚染された手袋で、いかなる実験器具も操作しないでください。
5. T. gondiiオーシストを扱う際は、必ず使い捨ての吸収性ライナーを敷いた、オートクレーブ可能な金属製トレイを使用してください。使用するラックやチューブなどが、すべて使い捨てであるか、またはオートクレーブ可能であることを確認してください。
6. すべてのT. gondii廃棄物は、少なくとも1時間、2回オートクレーブ滅菌しなければなりません。
7. すべての非使い捨て器具（ラック、トレイなど）も同様に、少なくとも1時間、2回オートクレーブ滅菌しなければなりません。
8. 液体の吸引に使用する真空ラインは、真空ポンプの汚染を防ぐため、Vacushield™フィルターに接続してください。
9. T. gondiiオーシストを用いた作業完了後、影響を受けたすべての実験台天板を消毒しなければなりません。調製直後の10%次亜塩素酸ナトリウムを作業区域にたっぷりと塗布し、乾燥させてください。その後、その区域を水で十分にすすいでください。

2. バッファーおよび溶液の調製

1. 752.66 gのスクロースを600 mlのddH₂Oに溶解し、1 Lの2.2 Mスクロース溶液を調製する。加熱攪拌機を用いて穏やかに加熱しながら攪拌し、スクロースを溶解させる。完全に溶解した後、ddH₂Oで全量を1 Lに調整する。その後、溶液をオートクレーブで20分間以上滅菌する。
2. 6.05 gのTris-HClと3.7 gのEDTAを700 mlのddH₂Oに加え、pHを7.2に調整した後、ddH₂Oで全量を1 Lにして、1 LのTEバッファー（50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA）、pH 7.2を調製する。
3. CsCl密度勾配用として、21.75 gのCsClを103.25 mlのTEバッファーに加えて、比重1.15のCsClストック溶液（1.15-CsCl）を調製する。溶液Aは、TE 30 mlと1.15-CsCl 20 mlを混合して調製する。溶液Bは、TE 20 ml、1.15-CsCl 30 ml、およびフェノールレッド溶液12.5 μlを混合して調製する。溶液Cは、TE 10 mlと1.15-CsCl 40 mlを混合して調製する（表1）。
4. 40 gのNaOHを800 mlのddH₂Oに溶解し、1 Lの1 N水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を調製する。溶解後、ddH₂Oで全量を1 Lに調整する。
5. 20 mlのH₂SO₄を980 mlのddH₂Oに混合し、1 Lの2%（体積比）H₂SO₄溶液を調製する。

3. ショ糖浮遊法

1. 2% H₂SO₄に含まれるT. gondiiオーシストの糞便懸濁液10 mlを、50 mlコニカル遠心チューブに加える。ここで、糞便懸濁液とは、既報⁸のショ糖浮遊法により前処理されたサンプルを指すことに留意されたい。感染猫から糞便サンプルを最初に採取した際、文献8に記載されているショ糖浮遊法で処理を行う。この追加のショ糖浮遊は、CsCl精製工程に持ち込まれる糞便デブリをさらに最小限に抑え、可能な限り純粋なT. gondiiオーシストを得るために必要である。
2. 糞便懸濁液に1 N NaOH 6 ml（3/5容量）を加え、2% H₂SO₄を中和する。ボルテックスミキサーで十分に混ぜ合わせる。
3. 糞便懸濁液に等量（16 ml）の2.2 Mショ糖を加え、最終濃度を1.1 Mとして、ボルテックスミキサーで十分に混ぜ合わせる。
4. 10 mlピペットを用いて、ショ糖/糞便懸濁液の上にddH₂O 10 mlを慎重に重層する。懸濁液を室温で、ブレーキなしの条件にて1,200 x gで20分間遠心分離する。
5. 上層の水層と界面層を慎重に回収し、ピペットを回さないようにして気液界面からピペッティングし、新しい50 mlコニカル遠心チューブに移す。界面層を回収する際は、ショ糖の混入を最小限に抑えることが重要である。
6. チューブをボルテックスし、残ったショ糖/糞便ペレット溶液を混ぜ合わせる。
7. 手順3.4および3.5を繰り返す。
8. 2つのオーシスト界面溶液の容量をddH₂Oで50 mlに調整し、室温で2,000 x gで10分間遠心分離する。
9. 各チューブから上澄みを吸引し、ペレットを5 mlのTEバッファーで再懸濁させ、オーシスト懸濁液を合わせて回収する。合計の回収容量は10 mlとなる。

4. CsCl密度勾配

1. 50 mlのポリカーボネート製Oak Ridgeチューブを用い、18ゲージの鈍端オートクレーブ可能スチール針を装着した50 mlシリンジと2方活栓を使用して、各層を慎重に下層へ重ねることで、不連続CsCl密度勾配を作成する。注：勾配層を容易に区別するため、溶液Bにフェノールレッドを添加している（表1）。
2. 以下の溶液を、記載された順にゆっくりとチューブに加える。このとき、流量が0.5 ml/secを超えないように注意すること。
   1. TE/オーシスト懸濁液試料 10 ml
   2. 溶液A 8 ml
   3. 溶液B 8 ml
   4. 溶液C 8 ml
3. Oak Ridgeチューブを、4 °Cで12,000 x gにて60分間、ブレーキなしで遠心分離する。固定角ローターの使用も可能だが、高速スイングバケットローターを使用すると、チューブ側壁への糞便残渣の塗布を最小限に抑えつつ、懸濁液試料からオーシストをより良好に分離できる。塗布の程度は糞便懸濁液の組成に依存するため、糞便懸濁液が極めて汚れている場合は、CsCl密度勾配分離を2回行う必要がある。
4. 遠心分離後、溶液AとBの間にある不透明または白色のオーシスト含有バンドを回収する。糞便残渣による汚染を最小限にするため、勾配を乱さないように直接オーシストバンドまで進み、10 mlピペットを用いてオーシスト界面を回収する。回収したオーシスト界面を新しい50 mlコニカル遠心チューブに移す。洗浄ステップでのオーシストのペレット化に支障をきたす可能性があるため、オーシスト界面を回収する際に吸引されるCsCl溶液の量を最小限にするように努める。
5. 30-40 mlのddH₂Oでオーシストを洗浄する。チューブを室温、2,000 x gで10分間、ブレーキなしで遠心分離する。オーシストペレットを乱さないように、上清を慎重に吸引除去する。この洗浄操作をさらに2回繰り返す。
6. 最終洗浄の終了後、上清を慎重に吸引除去し、ペレットを10 mlの2%硫酸に再懸濁して、使用時まで4 °Cで保存する。これでオーシストをさらに操作する準備が整った。オーシストの純度は、試料中に糞便残渣がないことを顕微鏡下で確認することでチェックできる。