変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE）

サマリー

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、一本鎖DNAを分離または500ヌクレオチドの上限に達した時点でRNAに使用されます。熱変性サンプルと非構造化一本鎖との組み合わせで尿素は、その分子量に応じてゲルマトリックス内に移行する。

要約

尿素PAGEまたは変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、二次的DNAまたはRNAの構造を変性し、分子量に基づいて、ポリアクリルアミドゲルマトリックス中のそれらの分離に使用される6月8日Mの尿素を、採用しています。 2から500塩基間のフラグメントは、単一のヌクレオチドのような小さな長さの違いが、この方法^1を用いて分離することができます。サンプルの移行は、選択されたアクリルアミドの濃度に依存する。ポリアクリルアミドの割合は低分子量のフラグメントを解消します。ゲルの実行中に尿素や45〜55 ° Cの温度の組み合わせは、非構造化DNAまたはRNA分子を分離することができます。

一般的にはこの方法は、一本鎖DNAまたはRNAの断片を、酵素的切断反応から次のような合成または標識オリゴヌクレオチドまたは製品を分析したり、精製するために必要です。

このビデオの記事では、変性尿素ポリアクリルアミドゲルを準備して実行する方法を示します。技術的なヒントは、元のプロトコルの^1,2に加えて、含まれています。

プロトコル

この実験的な手順のための完全かつ詳細なテキストプロトコルは、分子生物学におけるカレントプロトコールで使用可能です。ゲルサンドイッチの組み立てのため、ゲルの装置のための詳細なステップバイステップの手順はBioRad社のウェブサイト³に見つけることができます。

必要な機器：
ガラス板（内側と外側）
10cmのセル：10.1 × 7.3センチメートル（インナープレート）、10.1 × 8.2センチメートル（外板）、バイオラッド
20cmのセル：20 × 20センチ（内側のプレート）、20 × 22.3センチメートル（外側のプレート）、バイオラッド
0.5〜1.5ミリメートルゲルのコームとスペーサー
ゲルキャスティングスタンド
蓋とケーブルを含むゲル装置
高電圧電源
ヒーティングブロックまたは水浴
血清学的ピペットとピペットエイド
ピペットとピペットチップ
ゲルの乾燥機やスキャナ

試薬およびソリューション：
尿素（超高純度）
40％アクリルアミド溶液（29:1）
10 × TBE溶液（トリス - ホウ酸、EDTAバッファー）
脱イオン、蒸留水
TEMED
30％（w / v）の過硫酸アンモニウム溶液
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ディスカッション

1. バンドの鋭さは、いくつかの要因によって異なります。シャープなバンドのためにロードされたサンプルの量は、すなわち理想的には1から5μlの間、可能な限り小さくする必要があります。しかし、最大15μlをまだ受諾可能な解像度を確実にするロードすることができます。シャープなバンドの少ないサンプル量の結果。
2. バンドの質も、ゲルの厚さに依存しています。たとえば0.75 mmの薄いゲルは、厚さ1.5mmのゲルよりも良い結果を示す。
3. サンプルがゲルのポケットに等しく適用されていない場合は、バンドの形状はまた、ゲルローディング中に影響を及ぼすことができる。ローディングバッファーで10％グリセロールを含むこともより容易にゲルローディングとサンプルのシンク時に役立ちます。
4. 予想される製品（s）がロードする染料のいずれかと同じレベルで実行される場合、サンプルローディングバッファーに接続されている別の潜在的な問題は、発生する可能性があります。さらに、蛍光標識が使用されている場合、一部の色素は同じような波長で蛍光シグナルを示す。このパラメータが1の場合染料またはすべての染料を除去する場合は、この問題を解決することができます。それは大きさの標準と.......