自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Summary

電界印加による電極のアレイに - デジタルマイクロ流体は離散液滴の操作（ML〜NL）によって特徴付けられる技術です。それは急速な、シーケンシャル、小型自動生化学的アッセイを行うために非常に適しています。ここで、我々はいくつかのプロテオミクス処理ステップを自動化することのできるプラットフォームを報告する。

Abstract

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断と予後に有用となるバイオマーカーの発見を約束し、重要な新しい学問分野として浮上している。臨床プロテオミクスの手法が広く異なりますが、一般的な特徴は、非常に不均質流体（すなわち血清、全血、等）と分析に先立って（ⅱ）大規模な生化学的な処理からのタンパク質の抽出（I）が必要です。ここで、我々は臨床プロテオミクスで使用されているいくつかの処理ステップを統合した新しいデジタルマイクロフルイディクス（DMF）ベースの方法を報告する。これは、タンパク質抽出、溶化、還元、アルキル化および酵素消化を含みます。デジタルマイクロ流体は、ナノリットルマイクロリットルサイズの液滴を開いて表面上で操作されているマイクロ流体処理技術です。液滴は、誘電体層によって被覆されている電極の配列の上に配置されています - 電位が液滴に印加されると、電荷は誘電体の両側に蓄積する。料金は、液滴の位置を制御するために使用できる静電ハンドルとして機能し、シリーズ内の電極のシーケンスをバイアスすることで、液滴は、ディスペンス移動、マージ、ミックス、そして表面上に分割させることができます。従って、DMFは急速な、シーケンシャル、多段階、小型自動生化学的アッセイを行うための自然なフィット感です。これは、従来の方法（手動ピペッティングまたはロボットに依存する）よりも大幅に進歩を表しており、臨床プロテオミクスに有用な新たなツールとなる可能性があります。

玉蜀黍J. Jebrail、ヴィヴィアンN.ルック、そしてスティーブCCシーズーは、この作品にも同様に貢献した。

セルジオLSフレイレの現在のアドレスは600サウス43rdストリートに位置するフィラデルフィア科学大学、フィラデルフィア、PA 19104にあります。

Protocol

パート1：デバイスの作製

1. ピラニア溶液中で清浄なガラス基板（3:1濃硫酸：30％過酸化水素）。頻繁に攪拌しながら10分間ピラニア溶液中で基質にしておきます。
2. 脱イオン（DI）水で洗浄し、N ₂ガ ​​スで基板を乾燥した後、クロム蒸着（250nmの厚さ）のための電子ビームチャンバー内の基板を置きます。
3. クロムコーティングされた基質を脱水し、115℃で5分間ホットプレート上で焼いてからイソプロパノールで洗浄し、℃の
4. スピンコーティング（30秒、3000回転）により、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）で基板と素数を乾かします。シプリーS1811フォトレジストで再びスピンコート（同一のパラメータを使用して）。
5. プリベークホットプレート（100℃、2分）で、基板と、パターンマスクを介して5秒間紫外線（UV）照射への暴露によってフォトレジスト。
6. 純水で3分間と洗浄のためのシプリーMF 321開発者のUVに曝露基板を開発する。 100℃のホットプレート上でポストベーク℃で1分間。
7. 30秒のためにクロムエッチング液に浸漬することによって公開されているクロムエッチング残りのフォトレジストを除去するために10分間AZ300Tストリッパーに浸漬し、DI水ですすいでください。 DI水ですすぎ、N ₂ガ ​​スで乾燥した。
8. 預金2から5μmのクロムをパターン化基板のベアリング上に化学蒸着によるパリレン- C（絶縁性ポリマー）。預金スピンコーティングによるテフロンAFの50 nmの（表面の疎水性を作るために）60秒2000rpmで解決策（フロリナートFC - 40の1％重量/重量）ホットプレート上でポストベーク（160℃、10分）。
9. トッププレートを形成するために、コートのような上記非パターニング酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板上50nmのテフロンAF、。
10. ポストベークのホットプレート上で両方の基板（160℃、10分）。

パート2：デバイスのセットアップおよび自動化

1. "二皿"の構成で運用デジタルマイクロ流体デバイスでは^、1滴がボトム基板（パターン化電極を有する）と上部基板（一般的にITOから形成された一つの連続した、透明電極、と）の間に配置されています。
2. デバイスを設定するには、メスで優しくこすることにより底部基板のコンタクトパッドからのポリマーコーティングを取り除く。カップル40ピンコネクタ（図1a）と底部基板の露出パッドを。
3. 電源投入時にLabVIEW（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）、自作のコントロールボックス（ナショナルインスツルメンツのDAQPadをからの信号によって制御される高電圧リレーの配列を特色にする）、ファンクションジェネレータ、およびアンプを実行しているコンピュータ。コンピュータ/コントロールボックスは、100 V _RMS / 40ピンコネクタを介してデバイスに18 kHzの信号のアプリケーションをユーザが制御を容易にします。
4. 底部基板のエッジに配置両面テープの2つ（140μmの総厚を）して、デバイスを組み立て、無地ITOスライド（トッププレート）で完了します。
5. 制御システムを初期化するには、フィードバック制御を校正するには、LabVIEWのキャリブレーションプログラムを（社内で作成）を実行します。
6. 適切な貯水池（以下のセクション3を参照）に試料と試薬をロードし、上部基板（テフロンコーティングされた面が下向き）で囲みます。上部基板にアースコネクタを取り付けます。
7. LabVIEWでの作動のコードを（社内で作成）をロードし、液滴の作動を開始するプログラムを実行します。

パート3：サンプルと試薬の調製

1. 100mMのTrisHCl（pH7.8）中および0.08％プルロニックF127 w / vの：作業バッファ（WB）を準備する
2. 図1bに示すように、デバイス上でタンク1（R - 1）にWBとピペットのサンプルで分析するタンパク質（s）を、溶解する。
3. R - 2に沈殿剤、20％トリクロロDI水で酸（TCA）、およびピペットを準備します。
4. R - 4にバッファ、70/30クロロホルム/アセトニトリル（ACN）とピペットを洗う準備する。
5. R - 5にresolubilizingバッファ、100 mM重炭酸アンモニウム（pH8.0）におよび0.08％プルロニックF127 W / V、およびピペットを準備します。
6. R - 6にWBとピペットで10 mMで還元剤、 トリス （2 -カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を、溶解する。
7. R - 7にWBとピペットで12 mMでアルキル化剤、ヨードアセトアミド（IAM）を、溶解する。
8. R - 8への総タンパク質試料の濃度（上記、3.1参照）とピペットのTO1 / 5と同じ濃度でWBにトリプシンを溶解する。

パート4：デジタルマイクロ流体サンプル処理

1. 次の手順は、社内で書かれたLabVIEWコードによって自動的に実装されています。貯水池から分注された液滴の体積は、電極の大きさ（この場合は、液滴が〜600nLいる調剤）によって定義されます。
2. R - 1からの蛋白質含有試料の液滴とR - 2（図2、フレーム1）から沈殿剤の液滴を分注する。 two滴をマージして組み合わせて液滴がPRの降水量で、その結果、5分間インキュベートすることができます表面にoteins（図2、フレーム2-3）。廃液溜め、R - 3（図2、フレーム4）に離れて沈殿したタンパク質から上清を作動させる。
3. R - 4から洗浄緩衝液の三液滴を分注し、廃液溜めに沈殿したタンパク質を介してそれらを駆動する、R - 3（図2、フレーム5）。
4. 沈殿物を乾燥することができます、そしてR - 5からタンパク質へresolubilizingバッファーの液滴を分注する。沈殿物は（図2、フレーム6）に溶解するまで、バッファが20分間インキュベートすることができます。
5. R - 6から還元剤の液滴を分注し、サンプル液滴にマージ。円形のパターンで6電極間にそれを作動させることによって結合された液滴を混ぜる。液滴は、加湿チャンバー（図3、フレーム1-2）で、室温で1時間インキュベートすることができます。
6. （4.5のように）混合して、R - 7からアルキル化剤の液滴を分注し、サンプル液滴にマージ。光（図3、フレーム2-3）から保護され、液滴は、加湿チャンバー中、室温で15分間インキュベートすることができます。
7. R - 8からトリプシンの液滴を分注し、と（4.5のように）混合し、サンプル液滴にマージ。液滴は、37℃で3時間インキュベートする° Cのホットプレート上で加湿チャンバー（図3、フレーム3-4）に許可する。

第5部：ポストプロセッシングサンプル調製

1. 水中では2.5％トリフルオロ酢酸0.6 mLを加えることによって上部基板とクエンチの消化反応を取り外します。
2. 製造元の指示に従ってC18 ZipTipsを（ミリポア、ビルリカ、MA）を使用して急冷反応生成物を精製する。
3. 100mlの最終容量に純水で試料を精製希釈する。

第6部：質量分析

1. タンデム型質量分析計に交尾ナノHPLC上で処理されたサンプルを評価。 HPLCシステムは、Eksigent Technologies社からのものであり、トラップカラム（3mmの直径。C18ビーズ、150μmのID × 2.5センチ）と逆相分離カラム（3μmの径。C18ビーズ、75μmの内径xが装備されてここで使用15cm）に。ここで使用される質量分析装置は、サーモフィッシャーサイエンティフィックからLTQです。
2. 水中に5％のアセトニトリルを構成する移動相で5μL/minでトラップカラムに2μLのサンプルをロードします。 20％アセトニトリルから25分以上80％アセトニトリルの直線勾配を用いて0.5μL/minで逆相カラムでサンプルを分離。さらに10分間80％アセトニトリルで実行を継続。
3. タンデム質量分析法によってカラムをオフに溶出するバンドを分析する。仕事でここに報告された、溶離液はNewObjectiveからナノエレクトロスプレーエミッタ（10μmのIDにテーパー20μmのID）を介して質量分析計にサンプリングされます。
4. SEQUESTなどのデータベース検索プログラムを使用してサンプル中のタンパク質を識別する。本研究では、我々はBioworks 3.01（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に組み込まSEQUESTのバージョンを使用し、同定されたタンパク質は、1.0E - 03未満の確率のスコア（99.9％信頼区間に相当）、および時のシーケンスカバレッジを持っていた少なくとも30％（図4）。

図1（a）の画像が自動化された液滴の作動のための40ピンコネクタにDMFのデバイスを交配。 （b）デバイスの回路図は、サンプルやプロテオミクス精密検査に必要な試薬のポジショニングを描いた。

映画から図2。フレームは、20％TCA（沈殿剤）と30分の70％のクロロホルム/アセトニトリル（溶液をリンス）の自動抽出とBSAの精製を描いた。フレーム6で、沈殿したタンパク質は100 mM重炭酸アンモニウムの液滴に再溶解されています。

図3。逐次還元、アルキル化、およびresolubilizedタンパク質の液滴の消化を示す映画のフレーム。この図では、試薬は、わかりやすくするために染料で着色され、実際には、試薬の色ではありません。

デジタルマイクロフルイディクスで処理されたウシ血清アルブミンのサンプルの図4。MSのクロマトグラム。 25種類のペプチド（99.9％信頼区間）は44％の対応するシーケンスの範囲を同定した。

Discussion

プロテオミクスにおける標準化されたサンプルの取り扱いと処理の欠如は、フィールドのための主要な制限です。さらに、従来のマクロスケールのサンプルの処理は、サンプルの損失や汚染につながることができる複数のコンテナおよびソリューションの移転を伴います。これらの問題に対する潜在的な解決策は、デジタルマイクロ流体^1（DMF）に依存するサンプルの処理のための統合システムを形成することである。前作では、DMFは異種蛋白質含有溶液中の不要な汚染物を効率的に除去するために有用であることが示された²同様に、DMFは、統合に多段階の液相処理の統合（還元、アルキル化および消化）と互換であることが示されたデバイス。ここでは^3、我々は、液相処理に続く沈殿によるタンパク質抽出のための自動化された液滴の制御を完全に統合されたシステムを実証している。我々はこのような方法が広く採用されている場合、プロテオミクスサンプルの処理に内在する人間のエラーの大部分はより良い再現性を分析、その結果、除去できると推測している。要するに、我々は条件が正確に世界のどの研究室に重複することができるようにDMFは、アプリケーション...