ここでは、成人のゼブラフィッシュで眼窩の注入を行う方法を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
動物全体の薬物治療は、薬理学的および化学的遺伝学的研究の任意のモデルシステムに不可欠なツールです。静脈内（IV）注射は、多くの場合、関心のエージェントの配信の最も効果的かつ非侵襲的なフォームです。ゼブラフィッシュの（
プロトコル
パート1. 注入材料の調製
- Tg(globin:GFP)細胞：
- ヘパリン（1unit/ul）をコーティングした10ulピペットチップを用いて、鰓の後方を穿刺し、成体ドナー魚から採血する。
- 赤血球を吸引し、細胞バッファー（0.9X PBS + 5% FBS + 1% Pen/Strep）に分注する。
- 細胞懸濁液を40uMメッシュでろ過し、LeBlancらによって先に記載された方法に従い、血球計数器を用いて細胞濃度を測定する。
- 遠心分離して回収し、最終注入量が5ulを超えないように、目的の濃度で細胞バッファーに再懸濁する。本法では、レシピエント1匹あたり1.5-2 million cellsを注入する。
- デキストラン（Texas Red®）については、色素をDPBSに溶解し、最終注入濃度を10-12 mg/mLにする。魚1匹あたり4 uLを注入する計画とする。
パート2. 注射
- トリカイン（4.2ml (4mg/ml) トリカイン/魚の水100ml）を用いて魚を麻酔します。
- 注入前に、ハミルトンシリンジを70%エタノールで3〜4回洗浄します。その後、0.9X DPBSで3〜4回すすぎます。
- 湿らせたスポンジの上に、魚を背面が上で右向きになるように置きます。
- 右手でハミルトンシリンジを持ち、人差し指をプランジャーに置きます。左手で魚の体を軽く固定します。
- 針の刃先を上に向け、魚の目を時計に見立てたとき、針が7時の方向を指し、魚に対して45度の角度になるように配置します（図1）。
- 針を7時の方向に1〜2 mmゆっくりと挿入し、プランジャーをゆっくりと押し下げます。
- 新鮮なE3水の中で魚を回復させます。
- 異なる試薬を注入する際は、上述の手順に従って針を洗浄します。
- 細胞の凝集を防ぐため、数分おきに細胞懸濁液を軽く弾いて細胞を再懸濁させます。
- 感染を防ぐため、1週間はフローのない環境で飼育し、毎日換水を行います。この期間、魚はICU水（E3水38リットルあたり、Stress coat 10mL + pemafix 5mL + melafix 5mL）で飼育します。
パート3. 代表的な結果
正しく実施すれば、何らかの方法で標識された注入物質を可視化することが可能です。例えば、図2に示すように、Tg(globin:GFP)赤血球を注入した後すぐに、蛍光解剖顕微鏡下でレシピエントのcasper魚の血管系を循環している様子が観察されるはずです。同様に、Texas Red®を結合させた70kDaデキストランを後眼窩的に注入すると、透明な魚の血管系において直ちに可視化できます（図3）。また、Tg(β-actin:GFP)ドナー魚由来の蛍光腎細胞を、放射線照射したcasperレシピエント魚に後眼窩的に注入することも可能です。これらの細胞は最終的にレシピエントの骨髄へホーミングし（図4a）、その後数週間かけて腎臓を再構築することがあります（図4b）。
注入が浅すぎる場合、または針の角度が後眼窩静脈洞の腔を外れた場合、注入物質が目の周囲に溜まったり、外へ流れ出したりするのが観察されることがあります。逆に、注入が深すぎると、魚に組織損傷や過剰な出血が生じる可能性がありますが、それでも回復する場合もあります。正しく実施された場合、後眼窩注入後の死亡率は全注入魚の5%未満であり、血流への導入成功率は全注入魚の90%以上である必要があります。
図 1: 後眼窩注入法のイラスト。魚の右眼をアナログ時計に見立てており、7時の位置が正しい注入箇所に対応している。
図 2: 後眼窩注射から3日後の成体casper魚の尾部血管内を循環するTg(globin:GFP)赤血球。
図 3: 色素として用いたTexas Red® 結合70kDaデキストランの注入に成功し、透明な成魚であるcasper において蛍光性の血管系が構築された。これは標準的な個体 whole-animal 蛍光顕微鏡を用いて容易に観察できる。
図 4a: Tg(β-actin:GFP)ドナー魚から全腎髄細胞を後眼窩的に注入して3日後、照射した成体casperレシピエント魚の腎髄にホーミングする細胞を可視化できる。
図 4b: Tg(β-actin:GFP)ドナー魚からの全腎髄細胞を後眼窩的に注入して4週間後、放射線照射した成体casperレシピエント魚において、緑色のドナー全腎髄細胞によるレシピエント腎臓への再定着が可視化される。
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ディスカッション
成人ゼブラフィッシュにおける眼窩注入は死亡率の最も低い発生率と血流に注入された材料の納入の最高効率が得られます。ために注射スポットの性質上、穿刺は感染症と失血の量の発生を減少させる、迅速に治癒に表示されます。サイトであっても繰り返して、例えば、薬物の毎日注射するための短い時間の間に注入されることがあります。
薬物の大量は、単純に浸漬し、関心の薬物を含む水に浸漬されている魚で、成魚の伝統的な治療法を購入する必要があります。薬剤が動物の血流に直接注入されている場合には、はるかに小さい量はそれによって、実験コストを削減し、治療が必要です。浸漬によって魚の循環を入力するには大きすぎる特定の化合物の場合は、特定のペプチドの場合には、眼窩の注入も有利かもしれない。
さらに、RO注射は成魚で心腔内注射の技術よりも高速かつ容易なので、RO注射の別のアプリケーションでは、成人の化学遺伝学的スクリーニングが含まれる場合があります。このように、眼窩の注入は非常に化学的または化学的配信を必要とゼブラフィッシュの研究を促進するかもしれない。
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謝辞
この作品はハワードヒューズ医学研究所と胚造血の研究のためのNIHからの助成金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | 2106 | あらかじめ計量された300 USPユニットのバイアル |
| トリカイン-S | Western Chemical | MS-222 | |
| ダルベッコ’リン酸緩衝生理食塩水 | Invitrogen | 14190-144 | |
| デキストラン、テキサスレッド® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl22 0.33 mM MgSO₄2 | ||
| マイクロリッターシリンジ | Hamilton社 | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
参考文献
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
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再版と許可
