から毒素誘導とタンパク質抽出フザリウム属属。文化

プロトコルは、その完成のための16日を要します。時間枠は、図1に詳述されています。

バッファーの調製のための詳細

• 溶解バッファー（サンプルあたり3ML）の調製。
• 洗浄バッファー（サンプル当たり50mLの）の準備。このバッファはあらかじめ冷却して保存-20℃冷凍庫でさらに分析されるまで、全体の手順の間に氷上で保存する。
• 降水量のバッファー（サンプル当たり20mlの）の準備。全体の手順の実行中に必要とし、氷上に保持されるまで、このバッファは、冷凍庫で-20℃であらかじめ冷却して保存する必要があります。
• 仕事が優先的に4℃のコールドチャンバー℃に行われるべきである

真菌種

プロテオーム解析のために使用する3つの菌株は、それらの形態学的特徴と翻訳伸長因子α- 1分析（オドネルら、1998）に基づいてフザリウムgraminearumに分類された

これらの菌株はCRP -ガブリエルリップマンコレクションに所属し、維持し、で保存した - 80 ° C 15％グリセロール。

菌糸の準備

菌類は25℃、光と暗期を交互に各12時間で4日間V8で培養した。培養物は、毒素誘導媒体100 mLを含む250ミリリットルの三角フラスコに接種するために使用されたこれらの培養物の滅菌ブレードとピースを使用して断片化された。菌糸体を10日後に回収し、滅菌フィルターで文化をフィルタリングすることにより、培地から分離した。菌糸体を培地残基と他の化合物を除去するために滅菌水で3回洗浄した。私たちは、その後すぐに液体窒素を添加することにより、細胞を凍結し、-80試料を保管℃に

タンパク質抽出の一般的な説明

タンパク質サンプルは、図3Aおよび3Bに記載された方法を用いて抽出した。 フザリウム属のサンプルは、液体窒素中で粉砕され、粉体を10mlテフロンチューブに回収した。次いで、試料を10分間煮沸、溶解緩衝液で30分インキュベートし、室温（15分間12000グラム）で2回の遠心分離した。上清を一晩沈殿バッファーを-20℃で収集し、インキュベートした。 45分間4℃3万グラムで遠心分離後、沈殿したタンパク質のペレットを冷アセトンを含むDTTで3回洗浄した。最後に、ペレットは、空気乾燥され、タンパク質は、pHを8に調整し、標識バッファーでresolubilizedれた。 30mlのサブサンプルは、総タンパク質の定量に除去し、残りの上清を蛋白質の電気泳動まで-20℃で保存した。

図1の手順のタイムライン。

図2。複数の演算子のサンプル処理のためのスキーム。

図3a。

図3bは。してくださいここをクリックして図3aの拡大バージョンを参照する、またはここで 、図3bの大きいバージョンのために。

図3a - B蛋白質の抽出手順のフローチャート（1日目、B：二日目）。。

図4。タンパク質抽出物の1D絵。タンパク質は、溶岩の紫で染色されたゲルの端に青色の完全移行するまで実行されました。してくださいここをクリックして図4の拡大バージョンを参照すること。

Recent interest in proteomic approaches within the fungal biology domain led to an increased number of publications using this technique (as reviewed in Kim et al., 2007). Methods for protein extraction rely on a combination of extraction procedures; they are often scarcely described in the methodological sections and require expertise in dealing with the potential troubleshooting methods.

As for other "omics" approaches, setting standards for sample and data processing is essential in order to generate reliable scientific information. Moreover samples and procedures of manipulation should be adequately described in order to allow shared result interpretation among different "omics" experiments. This would be essential for fully exploiting potentiality of cross-data mining in genomics, proteomics, metabolomics, ... (Morrison et al., 2006). Minimum information about a proteomic experiment has been drafted and working groups have been established in order to tackle all the aspects of an experiment (Gel electrophoresis, Mass Spectrometry, Molecular Interactions, Protein Modifications, Proteomics Informatics, Sample Processing). At the moment no defined information are available on sample processing procedures. Given the importance of protein extraction procedures in determining the final quality of proteomic studies, in order to implement procedures that can increase standardization within the framework of MIAPE guidelines (Taylor et al., 2007), we proposed the use of a video protocol detailing sample processing. Video description of experiments may contribute substantially to increase the number of information on sample processing that may result in better reproducibility of "omics" experiments (Pasquali, 2007).

Indeed, reproducibility across laboratories is a fundamental requirement in order to guarantee validity of proteomics results (http://www.fixingproteomics.org). The cross-laboratory reproducibility is influenced by two factors: different instrumentations and different operators manipulating samples.

In the described protocol, we propose to perform biological replicates involving multiple operators (Figure 2 and video) to increase the reliability of data (i.e. technical variation of the results is taken into account).

The procedure described for protein extraction is based on SDS and heating. This was previously shown to guarantee a good purity and quantity of proteins (Bridge 1996). SDS coupled with boiling dissolves cell walls, hydrophobic proteins and prevents the formation of oligomers that abort precipitation of proteins. Boiling allows also inactivation of proteases. The same effect is produced also by EDTA, PMSF and complete mini protease inhibitor. DTT removes disulfide bridges in and between proteins facilitating protein solubilization.

In order to remove SDS before IEF, proteins are precipitated by acetone/TCA/DTT. Furthermore, acetone/TCA/DTT precipitation allows removing some contaminants such as lipids, nucleic acids, salts or/and phenolic compounds when these compounds are present. Like SDS, these molecules prevent a good migration during IEF. Following this precipitation, it is necessary to wash the precipitated proteins by acetone/DTT, in order to remove TCA as it can interfere with IEF.

A good sample preparation is the key to good results. For this, it is also essential to avoid contamination of proteins from the environment working with powder free gloves and respecting good laboratory practices. From a technical point of view, within the described protocol, the most critical steps for obtaining sufficient amounts and purity of proteins are two phases. First, the grinding phase where complete destruction of the cell is fundamental to release proteins; and second, the purification of total proteins, a phase encompassing the removal of the majority of lipids, DNA and other contaminants that may interfere with the migration of proteins.