このビデオでは、我々は、CD40 -活性化と免疫の誘導を研究するためにモデル抗原提示細胞（APC）として使用することができますC57BL / 6マウスの脾臓細胞からマウスB細胞、の拡張の手順を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
B細胞の研究は、CD40の活性化が、その抗原提示能を改善することが示されています。インターロイキン-4およびCD40リガンド（CD40L）で刺激したとき、ヒトB細胞は、高純度のCD40 - B細胞の非常に大きな金額に14日以内に末梢血の少量から困難なく拡張することができます（> 10
プロトコル
脾細胞からマウスCD40活性化B細胞（mCD40B）を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています：パート板として使用されるマウスCD40リガンド（CD40L）を発現するHeLa細胞（tmuCD40L HeLa細胞）の調製を示していますフィーダー細胞に結合した。パートBは、実際のマウスCD40 - Bの文化を説明します。
フィーダー細胞のA.準備（tmuCD40L HeLa細胞）
tmuCD40L HeLa細胞は完全にコンフルエントになることはありません接着ヒト上皮細胞株、です。細胞は、そのため1週間に2回分かれています。以上の6週間以上の培養が推奨されていません。
- 滅菌ピペットを用いて初代培養から古い培地を除去し、1 × PBS 10 mLで細胞を洗浄。洗浄後PBSを吸引除去する。
- 37℃で10-15分では75 cm 2のフラスコに1 ×トリプシン/ EDTAの4 mLを加え℃に細胞を分離するために穏やかなタッピングを使用してください。
- 野生型の培地10mLを追加し、トリプシンで消化を停止するように静かに回転さ。
- 滅菌ピペットで50mLのチューブに細胞懸濁液を移し、7分間265 xgで細胞をスピンダウン。
- 上清を除去し、野生型の培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液のアリコートの細胞数をカウントし、適切な数の細胞を3つの50 mLの試験管を準備します。
- サブカルチャーのための2.5 × 10 6細胞
- マウスCD40 - B細胞の培養に用いる/よく照射するための0.4 × 10 6細胞
- フリーズして残り（必要に応じて）。
- 7分間265 xgで細胞をスピンダウン。
- 上清を取り除く。
- 継代のための：再懸濁し、2.5 × 10 6細胞を75センチメートル2細胞培養フラスコ（細胞密度2.5 × 10 5細胞/ mL）10 mLの選択培地で、37で細胞をインキュベート· CO 2 5％のCを。週2回のセルを分割する。
- マウスCD40 - B細胞の培養には：1つの6ウェルプレートに2.4 × 10 6個の細胞を必要とする。 0.2 × 10 6細胞/ mLの密度で野生型の媒体にtmuCD40L HeLa細胞を再懸濁し、78 Gyの時にそれらを照射する。よくそれぞれ、37でそれらをインキュベート° C、5％のCO 2に細胞懸濁液のプレートを2mL。 tmuCD40L HeLa細胞の接着性のある時にB細胞の刺激のために、この準備のプレートを使用する（少なくとも4時間：顕微鏡を用いて密着性を確認するには、B細胞の刺激を開始するために24時間以上待機しません）。 （bに進みます。）
B.マウスCD40 - Bの細胞培養
CD40刺激（0日）のための脾細胞のI.の準備：
ご注意：あなたは、フィーダー細胞が接着していることを確かめる続行する前に。常にマウスインターロイキン-4、β-メルカプトエタノール、使用直前に増殖培地へのシクロスポリンの新鮮なソリューションを追加します。
- C57BL / 6マウス（ハプロタイプH - 2b）の脾臓を摘出し、10〜20 mLのDMEMで二回を洗うには、別のチューブから10mLをピペットチップでそれを転送することにより、ゲンタマイシン[15μg/mL]で補足。マウスの汚染物質（例えば、髪の毛）を転送することは避けてください。セルストレーナー（100μmの）を通すことによって脾臓をミンチし、培地の別の10mLでストレーナーをすすぐ。室温で7分間、265 × gで脾細胞をスピンダウン、フィコール密度遠心分離によってmuCD40 - B細胞の培地、および別のリンパ球7mlのに再懸濁します。その30分を450 × gで15 mLの試験管や遠心機で5 mLのマウスPancoll（室温で予熱）上の層の細胞を室温でブレーキなしで行うには。
- 界面で邪魔されずにリンパ球層を残し、上位層のほとんどをオフに描く。新鮮な50 mlチューブにリンパ球層を転送する、他の細胞を除去するために7分間265 × gでスピンダウンしてゲンタマイシン[15μg/mL]と30mLをDMEMで1回洗浄します。上清を捨て、mCD40 - B洗浄培地10mlに細胞を懸濁します。細胞懸濁液の一定量の細胞数を決定します。細胞懸濁液のアリコートをカウントすることにより、細胞数を決定します。
- 7分間265 xgで細胞の必要量をスピンダウン。 6ウェルプレート5の場合× 10 6細胞/ウェルこうしてプレート当たり30 × 10 6細胞、必要とされています。
- 上清を除去し、新鮮防ぐために、成長因子、100μMのβ-メルカプトエタノールおよびサイクロスポリン0.63μg/ mLのようにインターロイキン-4の1 U / mLのを補充mCD40 - B培地で1.25 × 10 6細胞/ mLでリンパ球を懸濁します。 T -細胞の伸長（考えると濃度が1枚のMLの培地を参照してください！）。
- tmuCD40L HeLa細胞とのプレインキュベート6 - ウェルプレートから上清を取り除く。
- 穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにリンパ球懸濁液を4mL（1.25 × 10 6細胞/ mL）を追加します。
- 37プレートをインキュベート℃、5％のCO 2。 3日目に細胞は（II.1に進みます。）reculture。
II。 mCD40B細胞（3日目とその後週2回）のサブカルチャー：
- 精力的に50 mlチューブに10 mLのピペットとプール一緒に上下にピペッティングにより収穫mCD40B細胞クラスター。
- 7分間265 xgでスピンダウンし、完全にmCD40 - B洗浄培地で上清を交換してください。アリコートの細胞の量をカウントしながら、7分間265 xgで細胞をスピンダウン。 0.75 × 10 6細胞/ mLの濃度でmCD40 - B培地で再懸濁しmCD40B細胞。
- 1 U / mLを、100μMのβ-メルカプトエタノール及び培地へのシクロスポリン0.63μg/ mLの濃度でマウスインターロイキン-4の新鮮なソリューションを追加。
- 6ウェルプレート照射tmuCD40L HeLa細胞でプレインキュベートから上清を取り除く。
- 穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにmCD40Bの細胞懸濁液を4mL（0.75 × 10 6細胞/ mL）を追加します。
- 37プレートをインキュベート℃、5％のCO 2。
- 再び14日間の合計の後に高純度マウスCD40活性化B細胞で終わるために3〜4日ごとに細胞を継代培養。
C.トラブルシューティング：何かのCD40 - B細胞は増殖しないのですか？
- あなたは、フィーダー細胞のCD40リガンド発現について確認しましたか？
- 24歳以上の刺激のために使用されるプレートに結合フィーダー細胞はありますか？
- マイコプラズマの混入はありますか？
- 補充のために使用されるインターロイキン- 4ソリューションは、新鮮に解凍され、それは適切な生物活性を持っているのですか？
- β-メルカプトエタノールおよびシクロスポリン正しい濃度で添加されたのはいつですか？
図1a。
図1b。
図1d。
図2。
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ディスカッション
このプロトコルの変更も、マウスCD40活性化B細胞の効率的な世代に降伏、特にCD40刺激し、使用されるマウス系統のタイプの起源について、可能な限りされています。アフマディら。 CD40 -リガンドマウスでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞に対して同様の結果が示されている。このコンテキストでは外来の抗原の提示を確実に除外されますが、in vivoでのセキュリティと毒性に関する集中的な研究は、炎症またはヒトトランスフェクトしたHeLa細胞を使用して、この設定で自動免疫反応の兆候を与えたことはできません。しかし、最善の選択肢は、我々の知る限りでは市販されていないと同時に、で活動を活性化し、増殖とCD40 -リガンド可溶性マウスを表します。
また、このプロトコルは129S2/SvPasマウス（ハプロタイプH - 2B）からのリンパ球には有効ですが、これまでのところ、さらにマウスの系統については評価されていない。さらに、細胞密度の調整の違い、サイトカイン濃度、シクロスポリンの持続治療、細胞培養培地と料理でも同様の増殖速度とマウスB細胞の効率的なCD40 -活性化につな...
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開示事項
実験は、実験動物の飼育のための国内及び欧州のガイドラインに従って行った。ドイツの動物福祉法を参照する動物は、適切な当局によって定期的に制御されていました。
謝辞
私たちは親切tmuCD40 - リガンド- HeLa細胞細胞株を提供するために博士はクレメンスWendtnerに感謝。
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材料
メディアのA.の準備：
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| フィーダー細胞の野生型媒体 | フィーダー細胞を選択培地 | ||
| 試薬 | 濃度 | 試薬 | 濃度 |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L -グルタミン | 300μg/ mLの | L -グルタミン | 300μg/ mLの |
| FBS | 10パーセント | FBS | 10パーセント |
| HEPES | 10 mMの | HEPES | 10 mMの |
| ゲンタマイシン | 15μg/ mLの | ゲンタマイシン | 15μg/ mLの |
| ハイグロマイシンB | は0.2 mg / mLの |
| mCD40 - Bの洗浄媒体 | mCD40 - B培地 | ||
|---|---|---|---|
| 試薬 | 濃度 | 試薬 | 濃度 |
| D - MEM | D - MEM | ||
| L -グルタミン | 580μg/ mLの | L -グルタミン | 580μg/ mLの |
| グルコース | 4.5 mg / mLの | グルコース | 4.5 mg / mLの |
| HEPES | 10 mMの | HEPES | 10 mMの |
| ゲンタマイシン | 15μg/ mLの | ゲンタマイシン | 15μg/ mLの |
| MEM | 0.1mmの（1X） | ||
| FBS | 10パーセント |
B.その他の試薬：
| 試薬 | 会社 | オーダーNo |
| RPMI 1640 | インビトロジェンギブコ | REF 21875 |
| D - MEM | インビトロジェンギブコ | REF 41965 |
| Dulbeccos PBS（10倍） | PAA | 猫なしH15 - 011 |
| Gencin | デルタの選択 | アートなし7395800 |
| FBS | ロンザ | 猫なしDE14 - 802C |
| HEPESバッファー | PAA | 猫なしS11 - 001 |
| MEM NEAA | インビトロジェンギブコ | REF 11140 |
| ハイグロマイシンB | PAA | 猫なしP02 - 015 |
| 組換えマウスインターロイキン-4 | Immunotools | 猫なし12340045 |
| シクロスポリン | ノバルティス | 猫なしNDC 0078-0109-01 |
| トリプシン/ EDTA（10倍） | インビトロジェンギブコ | REF 15400-054 |
C.その他の用品：
| 試薬 | 会社 | オーダーNo |
|---|---|---|
| 滅菌ピペットチップ | ザルスタット | |
| 6ウェルプレート | NUNC | 猫なし140675 |
| 50mLのコニカルチューブ | BDファルコン™ | 猫なし352070 |
| 組織培養フラスコ | ザルスタット | 猫なし83.1813.002 |
参考文献
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