活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

Summary

このビデオは利用してニワトリ胚脊髄の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路を可視化する方法を示しています卵のエレクトロポレーション。

Abstract

神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現を駆動するエンハンサーエレメントの雇用は、軸索投射を追跡するために広く使用されているパラダイムである。脊椎動物における脊髄介在ニューロンの軸索投射を追跡するために、生殖細胞ラインをターゲットとしたレポーター遺伝子としては、左右対称ラベルをもたらす。したがって、それは、IPSI -＆コントラ横方向に突出する軸索を区別するのは困難です。ひよこ神経管への一方的なエレクトロポレーションは、中枢神経系の一方の側にレポーター遺伝子の発現を制限するために、そして両側に軸索投射に従うことが有用な手段を提供します。

Protocol

I.エレクトロ

卵の取り扱い

1. ロッキングトレイ付きインキュベーター° C、好ましくは37から38への加湿インキュベーターセットに卵を置きます。
2. 胚は、彼らはハンバーガー＆ハミルトン（HH）ステージ18から20に到達したときに、インキュベーションの約66時間後に電気穿孔されています。この段階で頭がトランク（頸屈と呼ばれる状態）に直角に位置し、そのような、前方後方、左右の卵黄静脈のような余分な胚の血管の広大なセットを見られるべきである。これは、エンハンサー依存性の特異的発現を^1,3,4に最適なステージです。それは生存可能と同期胚を得るために、インキュベーターの温度と湿度を監視することが重要です。
3. インキュベーションの66時間後、インキュベーターから卵を取り除く。水平に卵を置きます。 5〜10分待ちます。胚は、現在卵の上極に位置しています。

準備

1. ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）（1:100希釈）とのハンクス溶液を準備します。
2. マイクロキャピラリーにガラスキャピラリーを（直径0.5mm）を引き出します。
3. マイクロマニピュレータに電極（タングステン）を配置し、パルス発生器（ECM 830）に電極を接続する。
4. - 3、パルス50msの長さは電圧30V、パルスの数：次のパラメータを使用してパルス発生器を調整します。
5. 口の中のピペット、シリンジの針やテープを準備します。
6. DNA（2-5μg/μl）の所望の混合物を準備し、ファストグリーン色素を追加します。

Windowingとエレクトロポレーション

1. シリンジを用いて、それぞれの卵からアルブミンの5-6 mlを削除します。
2. 小さなはさみで卵の上側に楕円形のウィンドウを開きます。
3. 0.5〜1ミリリットルハンクス+ P / Sソリューションと胚しっとり。
4. DNAの混合物とマイクロキャピラリーガラスをロードするために、口のピペットを使用してください。
5. あなたに向かって尾で胚を置きます。この段階で、胚の脊髄は、はっきりと見られている。したがって、何対照的なテクニックは必要ありません。脊髄は、両端、頭部と尾部で密封されていますが、あなたのマイクロキャピラリーが十分に薄い場合には、穿刺小さな穴をすることができると浅い角度で神経管を貫通される。右の直径のマイクロキャピラリーはそれを損傷することなくチューブを貫通し、定期的な呼気でDNAを放出、DNAで簡単にロードする必要があります。
6. 口のピペットを用いてDNAを注入する。緑色の染料は、脳の発達の小胞にまで尾の先端から広がるはず。
7. チューブ自体とパルスを触れることなく、はできるだけ近くに、神経管に平行に電極を配置。パルスの時に、電極が電気伝導を可能にするための液体で覆われている必要があります。通常、ハンクの物乞いで追加されたの量は十分です。パルスのハンクの直前の一滴を追加する場合ではない。
8. 慎重に電極を取り外して、テープで窓をシール。以下の潜伏期間中に胚の乾燥を防ぐために、完全に卵を密封することが重要です。
9. バックインキュベーターに卵を置きます。

II。脊髄のオープンブックの準備

胚から脊髄の脱離

1. 卵から、E6で、eletroporated胚を削除し、PBSを含有するシリコーンでコーティングしたペトリ皿に入れてください。
2. 膜を切り取ると、それを保持するためのピンを使用して、彼の腹側に胚を伸ばす​​。
3. 鋭いタングステンを使用すると、ダウンテールに後脳から、屋根板に沿って縦切開を作る微小毛細血管。
4. 離れて脊髄から後根神経節（DRGS）を切り離し、脊髄の両側にさらに2つの縦方向の切開を加えます。
5. 脊髄はそのままに、テールから後脳に始まる組織から床板を外してください。
6. 細かいハサミを使って後脳での横断面で脊髄を切断し、本体から分離する。

固定

1. 後脳からフラットマウント製剤を製造する尾にそれを保持するためにピンを使用してPBSを、、を含むシリコンを塗布した新しいペトリ皿の中で孤立した脊髄を広げる。
2. 皿からPBSを注ぎ、リン酸緩衝生理食塩水で4％パラホルムアルデヒドと交換してください。
3. 1時間室温でインキュベートする。

免疫組織化学

1. PBSで一次抗体を含むバイアルに固定された脊髄を転送します。
2. 4℃で一晩穏やかな扇動でインキュベート℃に
3. PBSで抗体X5回、穏やかな扇動と1時間ごとに洗浄を洗う。
4. 二次抗体を追加し、4℃で一晩穏やかな扇動でインキュベート℃に
5. それぞれ、PBSで抗体X5回洗浄する穏やかな扇動で1時間洗浄してください。

イメージング用取付開いた本

1. スミアのグリースまたはシリコンスライド上に四角形状にし、内にPBSを滴下。
2. ピンセットを使用して四角形の中央に張ら脊髄を置き、パスツールピペットを用いてその周りに液体を引き出す。
3. 脊髄への搭載メディアの1〜2滴を置き、カバースリップでカバーしています。スカッシュは、空気の泡を避けるために。
4. 4℃で暗所でスライドしてください
5. 共焦点顕微鏡を用いて脊髄を検査する。

Discussion

ニワトリ胚へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションは、生体内異所性発現のための強力な技術として進化しています。特定のエンハンサー、およびニワトリのエレクトロポレーションの組み合わせは、神経細胞^1,3,5の遺伝学的に定義されたグループの軸索経路を解読するための迅速かつ効率的なツールを提供しています。のCre / loxP部位とGal4/UAS増幅システムを活用すれば、表現のレベルと持続時間を増やすことができます。新興写真は、その軸索突起の方向によって定義された介在ニューロンの亜集団、から生じる軸索手がかりの複雑な相違である。さらに、2つの神経集団の同時分子との空間制限されたラベルを得ることができる。従って、神経回路³のアーキテクチャに関する情報を提供する。