COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

メッキCHO - K1細胞：

1. F - 12Kの完全の6ミリリットルの標準プロトコールに従ってトリプシン処理されているCHO - K1細胞を50 -100μLを加える。
2. その後、上下に数回ピペッティングして混合細胞懸濁液、＃1.5ホウケイ酸カバーガラスチャンバー（NalgeneヌンクのIntと滅菌8室のLab - Tek社IIチェンカバーガラスの各ウェルにトリプシン処理細胞懸濁液のアリコートを300μl;商品＃155409;ロット：100808-8-0）。
3. 37℃、5％CO ₂で一晩試料をインキュベートする。

pSNAP - ADRB2とpSNAP - H2BとCHO - K1細胞のトランジェントトランスフェクション：

1. 細胞密度と健康を探すために前日に播種された細胞培養チャンバーを確認してください。
2. マイクロチューブの適切な数のラベルを付けます。
3. 層流フードでは、トランスフェクション複合体混合物は、0.3μgのpSNAP - ADBR2コントロールプラスミドDNAまたはpSNAP - H2BのコントロールプラスミドDNA、TransPassのD2を1μlとTransPass V 1μlの0.3μgのいずれかを使用して、次のサンプルチャートに基づいて設定反応あたり。

   プラスミド	反応の数	無血清培地の液	TransPass D2の液	TransPass Vの添加	プラスミドDNAの添加	TransPassのD2/reactionμlの	TransPass V /反応の液	DNA /反応のNG	DNAコンク。 （ng /μlに）	プラスミドDNA /反応μlの
   SNAP - ADRb2	5	236.5	5	5	3.5	1	1	300	472.34	0.7
   H2B - SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515.89	0.6
   モック	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   トランスフェクトされていない	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. 最初に、適切なプラスミドDNAを無血清F - 12K混ぜ、その後TransPass Vトランスフェクション試薬を追加し、TransPass D2フェクション試薬を加える。各試薬の添加後、穏やかに数回ピペッティングでよく部品を混ぜる。
5. 30分間室温で反応します。
6. インキュベーションの間、完全DMEM600μlので細胞を1回洗浄し、各サンプルに完全DMEM 450μlを加える。
7. ゆっくりと滴下方式で、各サンプルにトランスフェクション複合体混合物の50μlを追加。
8. ° C、5％CO ₂ 37℃で一晩サンプルをインキュベートする。

一過性pSNAP - ADRB2とpSNAP - H2BでトランスフェクトしたCHO - K1細胞のSNAP -セルのTMRのスターラベル：

1. 慎重に真空吸引することにより、各サンプルからトランスフェクション複合メディアを削除します。 F - 12Kの完全な600μlで細胞を2回洗浄し、F - 12Kの完全な600μlで各ウェルの培地を交換してください。
2. 完全なF - 12Kと51μlの0.6 mMのSNAP -セルTMR -スター基板の995μlを添加して色素のラベリングのメディアを混在させる。 SNAP -セルのTMR - Starの最終濃度は、3mmにする必要があります。基質添加後混合して数回上下にピペッティング。
3. 慎重にサンプルから増殖培地を除去し、各ウェルに色素ラベリングメディアの200μlを加える。 37サンプルをインキュベート° C、30分間、5％CO _2を 。
4. 完全なF - 12Kの10mlに、サンプルはインキュベートされているが、ヘキスト33342、三塩酸塩、三水和​​物（Invitrogen社Molecular Probes社水に10 mg / mlの溶液を、16.2 mM溶液）1μlを混合して試料の核染色用にHoechst 33342を溶液を調製。
5. すべてのサンプルからメディアを取り出して、各サンプルの希釈ヘキスト溶液を600μlずつ加える。 37サンプルをインキュベート° C、5分間、5％CO _2を 。
6. F - 12Kの完全な600μlのサンプルを3回洗浄する。
7. 37サンプルをインキュベート° C、5％非法人の蛍光物質が細胞外に拡散するようにさらに30分間CO _2。
8. 30分後、最後にもう一度は、SNAP -細胞サンプルにメディアを変更し、画像処理に進みます。
9. ツァイス線分Axiovert 200M蛍光顕微鏡を用いて画像の細胞。

代表的な結果

図1ここです。SNAPタグ融合を表現しているライブCOS - 7細胞の標準的な蛍光顕微鏡を用いた蛍光イメージングのいくつか代表的な結果。この最初のイメージはSNAP -セルTMR -スターで標識pSNAP - H2Bを（ヒストン核）を発現するライブCOS - 7細胞を示しています。 pSNAP - H2BコンストラクトはpSNAP -タグ（m）のベクトルを用いて生成されました。細胞を30分間SNAP -セルのTMR -スターで標識し、核についてはヘキスト33342（青）で対比染色した。ピンクの蛍光は、ヒストンタンパク質が核を示す青色の蛍光に加えて存在する赤色蛍光のオーバーレイを示しています。 H2Bタンパク質の発現は、明確かつ容易に識別されます。

図2と図3。次の2つは画像が一時的にpSNAP -ADRβ2でトランスフェクトしたライブCOS - 7細胞を示す。
細胞は、SNAP -セルTMR -スター（赤）で標識し、ヘキスト33342（青）で対比染色した。 pSNAP -ADRβ2コンストラクトはpSNAP -タグ（m）のベクトルを用いて生成されました。細胞を30分間SNAP -セルのTMR -スターで標識し、核についてはヘキスト33342（青）で対比染色した。青色の蛍光が核を識別しながら、赤色の蛍光は、細胞表面の受容体タンパク質のADRB2の存在を示している。