β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42までと誘導

サマリー

アルツハイマー病の特徴のひとつは、Aβの上昇です。 _{1から42まで}ペプチド。ここでは合成Aβを製造するためのプロトコルを提供 _{1から42までオリゴマー、。この手順では、Aβ誘発性病態と薬剤スクリーニングのメカニズムを調べるのに便利です。}

要約

シナプス結合の減損は、アルツハイマー病（AD）の初期段階で発生する微妙な健忘の変化の根底にある可能性があります。 β-アミロイド（Aβ）、ADで多量に生産さペプチドは、細胞が学習と記憶の相関長期増強（LTP）を、減少させることが知られている。確かに、Aβに起因するLTPの障害は、ADのモデルで、そのようなシナプス障害を軽減または復帰が可能なスクリーニング薬のシナ​​プス機能障害を研究するための有用な実験パラダイムである。研究は、Aβがそのオリゴマーフォームを経由して優先的にLTP混乱をもたらすことが示されている。ここでは、オリゴマー合成の灌流による急性海馬スライスにAβ1- 42ペプチドを損なうLTPの詳細なプロトコルを提供しています。このビデオでは、我々はオリゴマーAβの調製のためのステップバイステップの手順を概説

プロトコル

再懸濁β-アミロイドペプチド

始める前には用意しておいてください。

• _Aβ1-42（凍結乾燥粉末）
• 1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール（HFIP）
• 低結合ポリプロピレン製微量遠心チューブ（1.5 ml）を
• テフロンのプランジストップ付気密ハミルトンシリンジ（250μl）を
• ジメチルスルホキシド（DMSO）

1. 凍結乾燥_{Aβ1-42は、}ペプチドバイアルを開くときに結露を避けるために、30分間室温で平衡させる。
2. ヒュームフードの下で、1 mM溶液と数秒間ボルテックス解を得るために、氷冷HFIPに_Aβ1-42ペプチドを再サスペンド。
3. テフロンプラグ付ガラス気密ハミルトンシリンジを使用して、迅速に等しくthreeポリプロピレンバイアルに_Aβ1-42 / HFIPソリューションを分割し、バイアルを密封する。
4. バイアルは、Aβmonomerizationを可能にするために2時間インキュベートする。次に、バイアルを開いて、明確なペプチド膜がバイアルの底部に観察されるまでSpeedVac遠心分離機（800グラム、室温）を用いて真空下で_Aβ1-42 / HFIPのソリューションを集中する。 （最大25 ° C）ペプチド分解を避けるために、Speed​​Vac遠心分離機内部に慎重に温度を確認してください。
5. バイアルを密封し、-80アリコート℃にて保存してください。 Aβフィルムは、6ヶ月間保存することができます。
6. 5mMの_Aβ1-42までの濃度を得るためにDMSOを添加して1フィルムを再懸濁する。再懸濁を完全に保証するために10分間水浴中に超音波処理。
7. ポリプロピレン製バイアルに分注しこの5mMの_Aβ1-42のソリューション。すべてのバイアルを密封し、-20℃で保管しますアリコートを解凍は1回限りです。冷凍庫内の水の結露について。溶液中のペプチドは、非常に容易に低下する。

オリゴマー化

始める前には用意しておいてください。

• _Aβ1-42 / DMSO（5mm）で
• 滅菌リン酸緩衝液
• 低結合ポリプロピレン製微量遠心チューブ（1.5 ml）を
• 低結合ポリプロピレン遠心チューブ（50ml）を

1. 滅菌リン酸緩衝液（最大100μl）を、得られた5mMの_Aβ1-42 / DMSOのアリコートを希釈する。
2. その後30秒間ボルテックスし、4℃で12時間インキュベート° C

海馬スライスの治療

海馬スライスを治療する際に、それはビーカー、灌流チューブの表面、および記録室への非特異的ペプチドの付着を回避することが重要です。優先的に低結合ポリプロピレンチューブと容器を使用してください。ガラスまたはプラスチック製のウェアのジェネリックの使用は避けてください。潅流媒体は、血清またはアルブミンフリーでなければなりません。

Aβ灌流

始める前には用意しておいてください。

• オリゴマー_Aβ1-42
• 録音バッファ（mMで：124のNaCl、4.4 KClを、1のNa ₂ HPO _4、25のNaHCO _3、2のCaCl _2、2のMgCl _2、および10グルコース）
• インタフェースのチャンバーとセットアップ電気生理学的記録
• 少なくとも90分後の解剖のために酸素を記録バッファー中でインキュベート横海馬スライス（T = 29℃、一定の血流速度は= 2ml /分）

1. 実験の直前に、事前に酸素記録バッファとポリプロピレンチューブに適切な作業の濃度（200nMのまたはそれ以上）にオリゴマー_Aβ1-42アリコートを希釈する。
2. シナプス可塑性の誘導の前にスライス〜20分間_、Aβ1-42のソリューションを灌流。

可塑性の誘導とフォローアップ

1. 通常は、シナプス可塑性の最も広く使用されているモデルはLTPです。それは、海馬内の特定のシナプスのテタヌス刺激によって誘導することができる。我々は、シェイファーの担保の予測と地層のradiatumのCA1錐体ニューロン間のシナプスからフィールドの応答を記録。私たちのテタヌス刺激は15秒間隔で区切られた3列車を含むシータバースト刺激で構成されています。各列車は、各バーストは、100Hzで5パルスを伴う5Hzで10バーストで構成されています。オリゴマーAβの血流が完了した直後にテタヌス刺激を適用します。
2. すぐにテタヌス刺激後に通常の録画用緩衝液で灌流に戻ります。実験期間を通じて一定の灌流速度、記録室の温度と適切な酸素化を維持する。

代表的な成果と可能性のある問題

スタインらcollの古典的なプロトコル^。1に記載のオリゴマーAβは、Aβモノマーとの様々な異なるサイズのオリゴマーを生成するS（二量体、三量体、など）オリゴマーの血流制御のスライスと比較してAβ処理のスライスに減少LTPに_Aβ1-42リード。コントロールのスライスでLTPの値が存在するあいだは3〜5ヶ月のC57BL/6J雄性マウスを使用している我々の実験条件の下で、LTPは200 nMでAβ処理のスライスは、テタヌス刺激後2時間におけるベースライン値の平均150パーセントになりますbaseline2の平均200から250パーセントで。いくつかのケースでは、Aβによる治療は、海馬LTPを減らすために失敗することがあります。発生する可能性のあるいくつかの重大なエラーは、Aβ濃度と不完全なオリゴマー化の間に乾燥過度のフィルムが含まれています。海馬切片におけるAβ灌流は、懸念のためにプラスチックに非特異的な接着が起こりやすいソリューションのAβペプチドの物理化学的性質の別のソースかもしれません。これらの問題のトラブルシューティングについては後述する。

ディスカッション

上述したように、オリゴマーAβの準備にはいくつかの問題が健常LTPになることがあります。 Aβ分解またはAβオリゴマー化の欠如が発生した可能性がありますかどうかを評価する一つの方法は、トリス - トリシンPAGE /ウエスタンブロット分析および分析超遠心を（このプロトコールに記載されていません）を使用してAβの準備を評価することです。ウェスタンブロッティングのサンプルがnon-denaturing/non-reducing条件下で調製されている場合、成功する準備はモノマーと異なるオリゴマー³に対応するバンドをフィーチャーしたウェスタンブロッティング署名を生成する必要があります。頻繁に発生する問題は、Speed​​Vacコンセントレータの乾燥工程中のペプチド不安定です。実際には、高温乾燥は、茶色に顕著なペプチドの着色によって顕著な、蛋白質の劣化につながります。 HFIP溶液の濃度は、室温で実施し、注意深く監視する必要があります。プロトコルで発生するいくつかの操作手順を与え、希釈のエラーが誤って悪いオリゴマーまたは誤解を招くようなAβ濃度につながる可能性があります。興味深いことに、提案されたよりも低いAβ濃度と血流が増...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Aβ 1-42 (凍結乾燥)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP)	Fluka	52517
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
50mL ポリプロピレン遠心チューブ	Corning	05-538-67
1.5ml MaxyClear マイクロチューブ（最大回収用）	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4	Invitrogen	10010-023
GASTIGHT シリンジ 250 μL	Hamilton Co	1725
バス型超音波洗浄機	Branson	3510
Savant SpeedVac 濃縮装置	Various	SC 110A