胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出

サマリー

このビデオでは、我々はマウス胚盤胞と胚盤胞から栄養膜幹細胞の派生の分離を示しています。我々はまた、幹細胞のプロパティのメンテナンスだけでなく、文化の分化誘導のための条件について説明します。

要約

栄養外胚葉の仕様は、哺乳類の発生の最も初期の分化のイベントの一つです。栄養外胚葉を仲介移植から派生し、絨毛の系統は、胎盤の胎児の一部を生成します。その結果、この系統の開発は、胚の生存に必須です。マウスの胚盤胞から栄養膜幹細胞（TS細胞）の導出は、最初に田中によって記述されていた

プロトコル

このプロトコルでは、我々はマウス胚盤胞とTS細胞の樹立の準備について説明します。自然交配と超排卵の誘導のために設定を含む事前の胚盤胞のコレクションへの一般的なマウス操作では、、基本的にはナギらによって示される標準のプロトコルに従ってください。2003（pp146 - 150）。

TS細胞の派生とメンテナンス

1. 興味のマウスとの間のセットアップの繁殖クロス。
2. フィーダー細胞としてマウス胚性繊維芽細胞（MEF）を準備する。二日胚盤胞の集合前に、MEFのは（2 × 10 ⁶細胞）は、100 mmディッシュに播種されています。翌日は、これらの細胞は37℃で2時間のインキュベーションのためにマイトマイシンC（20 mg / mL）を含む° C、5％CO _2の TSの培地10mlで処理されています。これは、PBSで細胞を2回洗浄することによって続いている。マイトマイシンC処理した細胞を12ウェルプレート（1 × 10 ⁵細胞/ウェル）に播種されています。
3. 胚盤胞のコレクション（3.5 DPC、初日と呼ばれる）の日に、MEFの培地は、TS培地に加えて倍速FGF4/Heparin液（0.5ml /ウェル）に置き換えられます。
4. 子宮のコレクションのための準備：マウスを安楽死させると子宮（図1A）を探します。
5. 子宮頸部（膀胱の後ろにある）で、ピンセットでそれを把握し、子宮を取り出して、子宮と子宮頸部（図1B）の接合間にカット。子宮を引っ張って、膜と脂肪組織を切り落とすと卵管との接合（図1C）下子宮をカット。 60 mmのプレート内のTS培地の少量（0.2 ml）に子宮（図1D）を配置します。
6. 26ゲージの針で1mlのシリンジを使用してTS培地1mlでそれぞれの子宮の角をフラッシュします。子宮の底に針を挿入し、1 mlのTS培地で新しい60 mmのプレートにゆっくりと洗い流してください。子宮が膨張し、フラッシング中に完全に拡張する必要があります。
7. 口制御ピペットを使用してTSの培地を含むクリーンな12ウェルプレートに慎重胚盤胞を収集して転送する。 12ウェルプレートでTS媒体を介してシリアル転送で胚盤胞を3回洗浄する。 37マイトマイシンC処理MEFフィーダーや文化を含む° C、5％CO _2を 12ウェルプレートにウェル当たり片足胚盤胞（図2A）。
8. 胚盤胞は透明帯から孵化し、24〜36時間でウェルにアタッチされます。小さな突起は容易に3日目に観察される。 500μlの新鮮なTSの培地に加え、1 × FGF4/Heparinと文化を養う。
9. 4または5日目に、胚盤胞の伸長は、そのサイズに応じて分解するための準備ができているはずです。 TSの細胞解離のための理想的なサイズは、図3Bに示されています。 0.5mlのPBSで一回の文化を洗ってください。 37℃で5分間、100ミリリットル0.25％トリプシン/ EDTAとインキュベートする° C、5％CO _2を 。 P100のpipettemanと激しく上下にピペッティングして小さな塊に伸長を破る。井戸に（30％のTS培地、70％MEF - CMプラス1.5 FGF4/Heparin）TS - 70CM - 1.5F4Hを追加することによって、トリプシン処理を停止します。 8時間分解した後、培地を変更し、2日毎に細胞を供給し続けます。
10. 日間で6と10（高度に可変）TS細胞のコロニーを観察することができます。彼らは明確なコロニーの境界（図2C）との形態のような平らな、上皮シートを持っている。 2日毎に培養液を供給し続ける
11. TS細胞がコンフルエント50％（通常は日15〜20の間）に到達すると、PBSで1回洗浄し、100ml 0.25％トリプシン/ EDTAを加える。近い単一細胞懸濁液を確実にするためにトリプシン処理中に上下にピペッティング。 TS - 70CM - 1.5F4HとマイトマイシンC処理したMEFフィーダー（2.5 × 10 ⁵ cells/6-wellまたは5 × 10 ⁵ cells/60mmプレート）を含む新たな6穴または60ミリメートルプレートへの転送を追加することにより、トリプシン処理を停止します。
12. 8時間経過後に培地を変更し、2日毎に培養液を供給し続けます。
13. MEFフィーダー上に1つまたは2つ以上の通路（通路の間に3〜5日）した後、TSの細胞はそれらなしで培養することができる。 MEFのは、はるかに高速にトリプシン処理後のTS細胞より培養皿に付着するので、接着速度でそのような違いは、MEFフィーダーからTS細胞を分離するために利用することができます。培養細胞を通過した後、° C、5％CO ₂で30分間37℃、それらをインキュベートする。ほとんどのMEFはプレートに付着し、TSの人口は、懸濁液中に残ります。新しいプレートに上清を移す。純粋なTSの人口を取得するには、いくつかの文章について、この手順を繰り返します。
14. TS - 70CM - 1.5F4HにTS細胞を維持し、4日ごとに渡す（1:10〜1:20の分割）や、文化が70％コンフルエントに達する。高密度（1:5分割よりも高い）または培養することを過度に合流、その分化を引き起こす可能性のある細胞を渡す。
15. TS細胞の同一性は、細胞マーカー、Cdx2の（図3）の免疫染色によって確認することができます。

凍結TS細胞

1. 凍結培地（50％FBS、30％のTS培地および20％DMSO）を2倍用意してください。
2. 共同トリプシン処理によってllectのTS細胞は、6分の場合は450gで遠心分離した。 2倍速凍結培地の等量でTS培地に再懸濁します。
3. 徐々に-70℃でイソプロピルアルコールチャンバーを用いて細胞を凍結℃、24〜48時間後に液体窒素への転送。
4. 60 mmのプレート（コンフルエント70％）通常2バイアルに保存されています。

TS細胞を融解

1. すぐに37バイアルを解凍° Cは、（450グラム、6分）遠心して10ミリリットルTSのメディアでそれらを収集し、そして30％TSメディア、70CM - 1.5F4Hに再懸濁します。
2. 細胞の1バイアルを60 mmのプレートに播種されています。

TGCにTS細胞の分化

栄養膜巨細胞（TGCs）にTS細胞の分化は、MEF - CM、FGF4とヘパリンの撤退により誘導され得る。 TGC表現型は（大核）は4日間の誘導後に検出することができる（田中ら、1998とチウら 2008）。 p450sccの免疫染色は、差別化された文化の中でこのTGCマーカー（図4A）の発現を検出する。 PI（ヨウ化プロピジウム）染色された細胞のフローサイトメトリー分析は、さらに高いDNA含量（図4B）を含む分化した細胞の存在を示しています。これらの結果は、TS細胞が倍数体TGCsになるために核内倍加を受けることを示唆している。

代表的な結果

図1マウスの子宮の解剖。 （A）子宮の位置は矢印で示されます。に示すように（B）子宮および子宮頸部の接合間にカット。 （C）だけで卵巣（OV）の下に卵管（外径）以下の子宮をカット。子宮の（D）イメージ。

図2代表的な写真は、マウスの胚盤胞、胚盤胞の伸長や栄養膜のコロニーを示しています。 （A）E3.5で収集されたマウスの胚盤胞が表示されます。 ICM、内部細胞塊、MT、壁画の栄養外胚葉、PT、極性の栄養外胚葉。 （B）MEFフィーダー上に栄養膜伸長が表示されます。 TS、栄養膜幹細胞。 （C）栄養膜幹細胞のコロニーは、MEFフィーダー上に明確なエッジを示しています。矢印は、セル境界を示している。

図3解析を免疫染色によりTS細胞の同定。 TS（AD）とES（制御、EH）の細胞は、マーカーの同定の対象となります。細胞は、Oct4の（A、E）またはCdx2の（B、F）を認識する抗体で免疫染色し、マージされた画像で提示DAPI（C、G）（D、H）によって対比されています。スケールバーは50μm。

図4 in vitroでのTS細胞の分化。 （A）未分化（Undiff）または差別化（差分）細胞培養においては、TGCのマーカーの発現について調べたところ、p450scc（緑）、DAPI（赤）で対比。 （B）PIで染色された分化した細胞のフローサイトメトリー分析は、DNAの内容を（; M2、以上の4つのコピーM1、2〜4枚）を測定します。 M2の人口は、倍数体栄養膜細胞を表しています。

ディスカッション

このビデオでは、我々は、TS細胞株を確立するために子宮や実験手順からE3.5胚盤胞を収集するプロセスを示しています。我々はまた、TS細胞のstemnessを維持し、分化した細胞への分化を誘導する条件について説明します。純粋なTS細胞株を取得する2つの重要なステップは、伸長の分解のためのタイミング（手順9）と初通過（ステップ11）処理です。それは、大規模な胚盤胞は、手順9または手順11でTSのコロニー（> 50％コンフルエント）（Kunathら、2005）の繁茂に脱却した後、原始内胚葉由来の細胞が培養で生じることが報告されている。原始内胚葉由来の細胞は丸みを帯びた細胞の形状やTS細胞と比較して減少した細胞間接触を持つ彼らの独特の形態によって識別することができますが、彼らはTSの培地でよく育つとしないので、それは文化からそれらを除去することは困難です。 MEFフィーダーまたはFGF4を必要とするように思われる。

差別TGCsもMEF - CMとFGF4の存在下でTSの文化の中で絶えず発生する可能性があります。純粋なTSの人口を希望する場合は、これらの分化細胞は、差動付着率に基づい...

材料

試薬

TS媒体：
RPMI - 1640、20％FBS、1mMピルビン酸ナトリウム、100mMのβ-メルカプトエタノール、100 mg / mlのペニシリン - ストレプトマイシン。

マイトマイシンC：
2ミリリットルのPBSで2 mgをマイトマイシンC（シグマM - 0503）を溶解し、200ミリリットルのTS培地（10 ng / ml）の中にこの2mlの混合物を追加。使用するまで-20℃で20分注し（10ml）とストアを行います。 100 mmのプレートごとに一定量を追加。

マウス胚性線維芽細胞条件培地（MEF - CM）：
100 mmのプレート（1 × 10 ⁶ /プレート）にプレートのMEF。翌日、皿当たり10mlのTS培地を追加し、48時間培養を続ける。それらをフィルタリング（0.45 mm）とを35mlのアリコートで-20℃で保存し、培養液を集める。 4℃で保存することができます必要に応じて各アリコート℃を解凍MEFのは、彼らがコンフルエントになる前に、CMの2つのバッチを準備するために使用することができます。

PBS / BSA：
0.45ミリメートルシリンジフィルターを通してフィルターPBS（10ml）に、のBSA、フラクションV（シグマA3311、0.1％（w / v）の）溶解し、1.5 mlチューブに1 mlのアリコートを行います。 -70℃で保存し、FGF4を準備するために必要な雪解けつのチューブを。

FGF4（1000X）：
PBS / BSA溶液1 mlで再懸濁し凍結乾燥FGF4（シグマF8424、25mg）を。 -70℃でよく混ぜ合わせ、1.5 mlチューブ用と店舗に10アリコート（100ml）を加える℃に必要に応じて各チューブを融解し、4で、残りを保存° Cは、再凍結しないでください。 1X FGF4（25 ng / ml）を取得するためにTS培地で1000倍に希釈する。

ヘパリン（1000倍）。
1 mg / mLの（1000倍）の最終濃度にPBSで再懸濁し、ヘパリン（シグマH3149、1万台）。 -70℃で1.5 mlチューブや店舗に100 mlのアリコートを作る℃に雪解けのアリコートに必要と4で、残りを保存° Cは、再凍結しないでください。 1Xヘパリン（は1 ng / ml）を得るために、TS培地中に1000時間を希釈する。