メタボロミクスのためのサンプル調製:代謝物プロファイリングのための細胞サンプル調製法

要約

出典: Zhao, Y. C. et. al., Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、代謝物プロファイリングのための乳がん細胞サンプルの準備技術について説明しています。乳がん細胞は、エストロゲン受容体αに結合して代謝物組成の変化を引き起こすエストラジオールで治療されます。

プロトコル

1. メタボロミクスアッセイサンプル調製

1. 細胞培養と治療
   1. 10 cmプレートあたり400,000個のMCF7細胞を増殖培地に播種します。各治療について3つのサンプルを準備します。各サンプルに2つのプレートを使用して、検出に十分な細胞を受け取ります。3日目に、培地を取り出し、10^〜8 MエストラジオールまたはE2の有無にかかわらず、5 mLの新鮮な培地を細胞に加えます。細胞を24時間(加湿した5%_CO2雰囲気中で37°C)処理します。
2. サンプルコレクション
   1. 5 mlの氷冷した1x PBSをプレートに加え、プレートを数回短く傾けた後、PBSを吸引します。2回繰り返し、最後の洗浄後にできるだけ多くのPBSを取り除きます。
   2. 各プレートに750 μlの予冷アセトンを加え、細胞をこすり落とします。2つのプレートからアセトン中の細胞を氷上の2 mLチューブに結合します。
   3. 正規化のためのセル数
      1. 各処理について、細胞定量用に2つの追加のプレートを使用します。プレートから細胞を分離するには、2 mLのHEバッファー(1x HBSS、10 mM HEPES、0.075% NaHCO_3、および1 mM EDTA)を各プレートに加え、5分間インキュベー
      トします。
      2. HEバッファー内で細胞をピペッティングすることにより、細胞をよく収集して混合します。合計20μlの細胞溶液を使用して、血球計算盤で細胞数をカウントします。
3. サンプルを-80°Cで保存してからメタボロミクスセンターに送り、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)分析を使用して代謝物を同定および定量します。